基于超滤离心前处理的液相色谱-串联质谱法手性拆分人血浆中的亚叶酸和5-甲基四氢叶酸非对映异构体及其药代动力学应用

徐陈凤, 惠文凯, 孙莉莉, 高倩倩, 邹巧根*

(1. 南京工业大学, 江苏 南京 211800; 2. 正大天晴药业集团股份有限公司, 江苏 连云港 222000; 3. 海纳医药科技股份有限公司, 江苏 南京 210009)

亚叶酸(leucovorin, LV)为四氢叶酸在体内的次生代谢产物(结构见图1),是合成核酸的主要辅酶,也是四氢叶酸在体内的活性形式之一。亚叶酸能有效对抗甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)引起的毒性反应,作为大剂量甲氨蝶呤的解救剂[1,2],是最早使用的化学保护剂;亚叶酸也能提升氟嘧啶类化合物的细胞毒性,是多种癌症如胃癌和结直肠癌[3]联合化疗药物中广泛使用的化疗辅助药物。亚叶酸一般以非对映异构体混合物的形式存在,临床试验证明,亚叶酸的生物活性物质为左旋体,称为左亚叶酸(6S-LV),在体内会经肝脏迅速代谢为活性代谢产物6S-5-甲基四氢叶酸[4,5](6S-5-methyltetrahydrofolate, 6S-5-MeTHF),右亚叶酸(6R-LV)则基本无药理活性[6]。

图 1 亚叶酸和5-甲基四氢叶酸的化学结构Fig. 1 Chemical structures of leucovorin (LV) and5-methyltetrahydrofolate (5-MeTHF)* The chiral center.

左亚叶酸的首次分离是在1952年实现的[7]。现有测定亚叶酸及5-甲基四氢叶酸(5-methyltetrahydrofolate, 5-MeTHF,结构见图1)的分析方法多为液相色谱法[8-10]和LC-MS/MS法[11-13]。Schleyer等[10]开发的液相色谱法能同时拆分亚叶酸和5-甲基四氢叶酸两对非对映异构体,但其流动相采用磷酸盐缓冲体系,不适用于液相色谱-质谱联用系统,同时该方法灵敏度低。Liu等[11]开发的LC-MS/MS法,在仅达到基本基线分离的情况下,需使用两个方法才能将亚叶酸和5-甲基四氢叶酸两对非对映异构体拆分;同时该方法前处理步骤繁琐、耗时长,不适用于大批量生物样本检测。早期文献[12]则采用复杂的柱切换技术,方法耗时且灵敏度低。

手性是生物系统的基本特征之一,目前临床上所用药物中约40%是手性药物[14],除天然产物外,约75%的合成手性药物则是以外消旋体的形式存在[15]。药物对映体立体化学的不同使其与各受体的亲和力不同,导致药理作用的差异极大,如张怡颖等[16]拆分了存在一个不对称手性中心的甲基苯丙胺(methamphetamine, METH),其S-(+)-METH和R-(-)-METH对中枢神经作用和毒性机制均有很大不同。由此可见,在进行临床药物代谢动力学与血药浓度检测时有必要从对映体的药效学角度来选择测定的目标化合物。

本研究建立了基于超滤离心前处理且能够同时定量拆分人血浆中亚叶酸和5-甲基四氢叶酸两对非对映异构体的LC-MS/MS法。该方法快速、简便、灵敏度高,已成功应用于人体药物代谢动力学研究,同时能为后期进行左亚叶酸制剂生物等效性研究提供技术支持。

表 1 工作溶液的质量浓度

STD: standard sample; LLOQ: lower limit of quantification; LQC: low quantification; MQC: middle quantification; HQC: high quantification.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

安捷伦1100液相色谱仪(美国Agilent Technologies公司)串联API 4000 Q Trap质谱(加拿大AB Sciex公司),配备数据采集软件Analyst 1.6.3。

亚叶酸对照品(钙盐,纯度85.6%,批号100252-101204)和甲氨蝶呤对照品(纯度99.8%,批号100138-201606)均购自中国食品药品检定研究院;5-甲基四氢叶酸对照品(钙盐,纯度99.0%,批号F0M040,美国USP Certificate);甲醇、三氟乙酸铵、乙酸、巯基乙醇、乙酸铵和抗坏血酸(均为色谱级,阿拉丁公司)。受试制剂(T1):注射用左亚叶酸钠(50 mg,批号160421201-1,南京海纳医药科技股份有限公司);参比制剂(R1):注射用亚叶酸钠(100 mg,批号21415002-3,武汉人福药业有限责任公司)。

1.2 标准溶液与标准加样血浆的配制

精密称取适量亚叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲氨蝶呤对照品,经质量校正系数校正后,将其溶于50%(体积分数,下同)甲醇-水(含500 mg/L巯基乙醇和抗坏血酸)中,得到最终质量浓度分别为200、200、100 mg/L的储备液,分装后置于-80 ℃冰箱保存。以50%甲醇-水(含500 mg/L巯基乙醇和抗坏血酸)为溶剂稀释亚叶酸和5-甲基四氢叶酸储备液,获得8个水平的标准曲线样品系列工作溶液(STD1～STD8)和5个水平的质控样品系列工作溶液(定量下限质控样品简写为LLOQ,低浓度质控样品简写为LQC,中浓度质控样品简写为MQC,高浓度质控样品简写为HQC,定量上限质控样品简写为ULOQ),工作溶液具体质量浓度见表1。所有工作液均置于-20 ℃冰箱保存。取20 μL相应工作溶液加入380 μL空白血浆,配制成相应标准加样血浆。

1.3 样品前处理

精密移取200 μL血浆,加入50 μL内标工作液(含500 μg/L甲氨蝶呤)、500 μL甲醇,涡旋3 min,于4 ℃以12 000 r/min的速度离心10 min,取450 μL上清至孔径为3 kDa的0.5 mL超滤离心管中,于4 ℃以12 000 r/min的速度离心20 min,收集滤液待分析。

1.4 LC-MS/MS条件

色谱柱:手性HSA柱(150 mm×4 mm, 5 μm,英国Chrom Tech Inc);柱温:25 ℃;自动进样器温度:4 ℃;流动相A: 10 mmol/L乙酸铵(用冰醋酸调节pH至8.0);流动相B:乙腈;进样量:20 μL。梯度洗脱程序:0～0.5 min, 100%A; 0.5～2.5 min, 100%A～85%A; 2.5～10.0 min, 85%A; 10.0～12.0 min, 85%A～100%A; 12.0～14.0 min, 100%A。

正离子电喷雾离子(ESI)源;多反应监测(MRM)模式;离子化电压为5 000 V;离子源温度为600 ℃;气帘气(CUR)流速为25 L/h;锥孔气(GS1)流速为45 L/min;去溶剂气(GS2)流速为40 L/min。去簇电压(DP)、入口电压(EP)、碰撞能量(CE)、碰撞池出口电压(CXP)及其他条件见表2。

1.5 临床试验方案

本试验经皖南医学院第一附属医院医学伦理委员会审批,合理可行。筛选6位健康志愿受试者,试验前签署知情同意书。

研究采用单中心、两制剂、两周期、交叉试验设计。每周期试验的第1天早晨,所有受试者在复查生命体征后,埋置静脉留置导管,并于给药前0.5和0 h采集空白血样。受试者在2 h内分别静脉滴注125 mg/m26R,S-LV或62.5 mg/m26S-LV,于给药后0.25、0.5、1.0、1.5、2.0(给药结束)、2.25、2.5、2.75、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、12、24、36、48 h由前臂静脉采血4 mL,记录实际采血时间。所采集的血样置于5 mL一次性负压枸橼酸钠抗凝采血管中,于4 ℃以12 000 r/min的速度离心10 min,分离出的血浆样本中加入含有50 mg/L的抗坏血酸和50 mg/L巯基乙醇甲醇溶液,置于已标记好的Axygen试管中,于-80 ℃的低温冰箱中保存待测。

表 2 质谱参数的优化

DP: declustering potential; EP: entrance potential; CE: collision energy; CXP: collision cell exit potential; IS: internal standard.

2 结果与讨论

2.1 血浆样品前处理优化

在生物样品分析研究中样品前处理步骤关系到测定灵敏度和研究结果的可靠性。本研究采用简便快速的蛋白质沉淀和液液萃取法进行样品前处理。但发现蛋白质沉淀存在严重的基质效应,而液液萃取则提取回收率低,无法满足试验所需灵敏度。因此,传统的前处理方法并不能达到令人满意的结果。Liu等[11]报道了一种蛋白质沉淀-固相萃取预处理方法,该方法无基质效应,且提取回收率较高,但该方法前处理步骤繁琐且耗时长,需花费近5 h来完成整个前处理过程,检测效率较低,不适用于大批量血浆样本的检测。

超滤技术是介于微滤和纳滤之间的一种膜分离技术,平均孔径为3～100 nm,具有净化、分离、浓缩溶液等功能,其截留机理主要包括膜的筛分作用和静电作用,常应用于蛋白质浓缩[17]和测定血浆蛋白质结合率。近年来,超滤离心结合蛋白质沉淀[18]和添加解离剂[19]已成功应用于样品前处理和临床研究中的在线监测。在本研究中由于6R-LV和6S-LV的血浆蛋白质结合率不同,因此难以确定既满足使结合药物完全释放又无蛋白质沉淀现象出现的解离剂体积。故最终选用超滤离心结合蛋白质沉淀作为样品前处理方法。

超滤离心滤膜的孔径大小和离心时间可影响亚叶酸和5-甲基四氢叶酸非对映异构体的提取回收率。本研究在保持其他参数恒定的情况下测试了3种不同孔径(3、10和50 kDa)超滤离心管的提取情况。结果显示3 kDa孔径超滤离心管最适宜。因为10和50 kDa孔径超滤离心管具有严重的基质效应;而3 kDa孔径超滤离心管非特异性吸附效应更强,但其灵敏度仍满足要求。

离心时间经过考察确定为20 min,更长的离心时间并不会增加待测物的回收率。

2.2 方法学验证

方法学验证内容与接受标准参考美国食品药品监督管理局[20]最新指导原则。

2.2.1专属性

为消除空白血浆中内源性亚叶酸和5-甲基四氢叶酸的干扰,将空白血浆按如下方法[10]处理:向空白血浆中加入适量甲酸,使内源性叶酸降解,然后用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.4。

取6批不同来源的空白血浆,按1.3节方法(其中内标工作液用含500 mg/L巯基乙醇和抗坏血酸的50%甲醇-水代替)处理后进样。取空白血浆配制定量下限(LLOQ)质量浓度(含25 μg/L 6R-LV、25 μg/L 6S-LV、12.5 μg/L 6R-5-MeTHF、12.5 μg/L 6S-5-MeTHF)的血浆样品及健康受试者静脉注射125 mg/m26R,S-LV、62.5 mg/m26S-LV 2.5 h后的血浆样品,按1.3节方法处理后进样,色谱图见图2。结果显示,亚叶酸非对映异构体和5-甲基四氢叶酸非对映异构体均完全分离,血浆内源性物质不干扰测定,同时待测物与内标的测定互不干扰。

2.2.2线性试验

按1.2节方法配制相应浓度的标准曲线样品工作溶液,取20 μL工作溶液,加入380 μL空白血浆,稀释成标准曲线样品,按1.3节方法处理进样。以待测物与内标的峰面积比值Y为纵坐标、待测物血样质量浓度X(单位μg/L)为横坐标进行线性回归,得到待测物6R-LV、6S-LV、6R-5-MeTHF和6S-5-MeTHF的回归方程分别为Y=3.53×10-4X+1.01×10-3、Y=3.7×10-4X+1.47×10-3、Y=1.78×10-3X+2.51×10-3和Y=1.71×10-3X+1.09×10-3;相关系数r分别为0.999 0、0.999 1、0.998 9和0.998 2。结果显示各待测物线性关系良好。

2.2.3准确度、精密度与稳定性

按1.2节方法,配制相应浓度的质控样品工作溶液。取75 μL相应工作溶液,加入1 425 μL空白血浆,稀释成质控样品。按1.3节方法处理后进样。每个浓度有6份重复质控样品。连续测定3批,至少分两天完成。准确度精密度结果见表3。

表 3 亚叶酸和5-甲基四氢叶酸在不同加标水平下的准确度和精密度(n=6)

表 4亚叶酸和5-甲基四氢叶酸在不同加标水平下的基质效应和回收率(n=6)

Table 3Matrix effects and recoveries of LV and 5-MeTHFunder different spiked levels (n=6)

同上制备低、高浓度质控样品(LQC、HQC)若干份,其中6份按1.3节方法处理后立即进样,然后将该样品置于4 ℃进样器,放置52 h后再进样测定。另取6份反复冻融3次,6份避光于室温放置4 h, 6份于-80 ℃下保存30 d,然后将这18份血浆样品按1.3节方法处理后进样测定,将样品的测得浓度与理论浓度相比较;同时考察储备液于-80 ℃下保存30 d、工作液于室温放置4 h和-20 ℃下保存3 d的检测结果,结果表明其偏差均在±15%范围内。可见,在以上条件下亚叶酸与5-甲基四氢叶酸的稳定性均良好。

2.2.4提取回收率与基质效应

按2.2.3节方法配制低、中、高浓度质控样品(LQC、MQC、HQC),对基质效应和提取回收率进行考察。血浆中待测物的提取回收率和经内标归一化的基质效应考察结果见表4。内标甲氨蝶呤提取回收率为(78.9±0.04)%。结果表明,在本试验条件下,待测物的回收率均良好,血浆基质效应对测定无影响。

2.2.5稀释准确性验证

按1.2节方法配制含400 mg/L 6R-LV、400 mg/L 6S-LV、240 mg/L 6R-5-MeTHF和240 mg/L 6S-5-MeTHF的工作溶液,取20 μL该工作溶液,加入380 μL空白血浆,配制成含20 mg/L 6R-LV、20 mg/L 6S-LV、6 mg/L 6R-5-MeTHF、6 mg/L 6S-5-MeTHF的稀释质控样品(DQC)。取50 μL DQC,加入150 μL空白血浆,得到进一步稀释后的DQC,平行制备6份,按1.3节方法处理后进样。结果显示,所有经稀释后的DQC检测结果的平均值相对于理论值的偏差在±15.0%以内,所有DQC检测结果标准偏差为5.63%,表明该方法稀释准确性良好。

2.3 药代动力学研究

采用本方法测定6名健康受试者静脉滴注125 mg/m26R,S-LV和62.5 mg/m26S-LV后的血药浓度,以时间(单位为h)为横坐标、测定的血药质量浓度(单位为μg/L)为纵坐标绘制标准曲线,活性成分6S-LV和6S-5-MeTHF的平均血药浓度-时间曲线见图3; DAS 3.2.8软件计算的药代动力学参数见表5。

图 3 受试者静脉注射62.5 mg/m26S-LV和125 mg/m26R,S-LV后活性成分6S-LV和6S-5-MeTHF平均血药浓度-时间曲线(n=6)Fig. 3 Mean drug mass concentration-time profiles of 6S-LV and 6S-5-MeTHF in human plasma afterintravenous administration of 62.5 mg/m26S-LV and 125 mg/m26R,S-LV (n=6)

表 5 主要药代动力学参数(n=6)

Cmax: maximum observed concentration; AUC0-t: area under the curve from the time of dosing (dosing-time) to the last measurable concentration;Tmax: time of Cmax;t1/2: terminal half-life; CL: apparent total body clearance;V: apparent volume of distribution.

表 6 6S-LV和6S-5-MeTHF药代动力学参数等效性评价(n=6)

AUC0-∞: area under the curve from dosing time extrapolated to infinity, based on the last predicted concentration;T1/R1: the relevant parameter of 62.5 mg/m26S-leucovorin dosage divided by 125 mg/m26R,S-leucovorin; CV: coefficient of variation.

结果显示,受试者给予125 mg/m26R,S-LV和62.5 mg/m26S-LV后,均未在体内检测到6R-5-MeTHF,表明6R-5-MeTHF不会在体内生成;同时,受试者给予62.5 mg/m26S-LV后,未在体内检测到6R-LV,表明体内未发生药物手性转置。以相同剂量6S-LV计,受试者给予单一左旋体或外消旋体后,对体内有效成分6S-LV和6S-5-MeTHF主要药代动力学参数(血浆峰浓度Cmax、从时间点0到最后可定量时间点的药物代谢动力学时间曲线下面积AUC0-t、从时间点0到无限的药物代谢动力学时间曲线下面积AUC0-∞)剂量校正后再进行自然对数转换,然后对其进行方差分析,并进一步采用双向单侧T检验和(1-2α)%(检验水准,α=0.05)置信区间法进行受试者给予125 mg/m26R,S-LV和62.5 mg/m26S-LV后体内活性成分药代动力学参数的等效性评价,具体结果见表6。同时对体内有效成分6S-LV和6S-5-MeTHF的达峰时间(Tmax)采用非参数(Wilcoxon符号秩检验)检验法进行检验,P>0.05。以上结果证明,受试者给予125 mg/m26R,S-LV和62.5 mg/m26S-LV后,体内有效成分6S-LV和6S-5-MeTHF的主要药物代谢动力学参数均无显著差异,药物代谢动力学特征一致,吸收的速度和程度一致。

3 结论

本文建立了基于超滤离心前处理且能够同时定量拆分人血浆中亚叶酸和5-甲基四氢叶酸两对非对映异构体的HPLC-MS/MS法。相较于之前的研究,该方法在消除基质效应的前提下,比固相萃取前处理操作简单且耗时短,极大地提高了生物样品检测的效率,同时还具有灵敏度高、选择性好等优点。已成功应用于人体药代动力学研究,并能够为后期进行左亚叶酸制剂人体生物等效性研究提供技术支持。

本文成功将超滤离心技术运用于生物样品前处理,揭示了其在生物样品前处理运用中的前景。超滤离心应用于生物样品前处理仍存在一些需要改进和继续研究的内容,而其中非特异性吸附导致的回收率低则是首要难关,因为这将限制超滤离心在高灵敏度检测中的应用,这些现存问题将在后续研究中深入讨论。