苯扎贝特联合顺铂抑制肺腺癌裸鼠移植瘤的生长及其机制研究*

王桂平，李智斌，张彦焘，刘新艳

(1.广州卫生职业技术学院药学系，广州 510180；2.广州医科大学杂志社，广州 510182)

肺癌是世界上癌症患者死亡的主要原因之一，对人类健康和生命威胁很大。早期手术仍是肺癌治疗最为有效的方法，但不幸的是，70%的肺癌发现时已进展为晚期，失去了手术治疗最佳时期。化疗是目前失去手术机会的肺癌治疗的主要手段，但肿瘤多药耐药的产生成为化疗的主要阻碍，因此，发现新的高效低毒的治疗药物，对延长肺癌患者的生命及降低死亡率有着迫切的临床需要。 过氧化物酶增殖激活受体 (peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)属于核激素受体超家族的成员，包括PPARα、PPARγ和PPARδ 3种亚型 ，其中PPARα主要参与调节脂质代谢与糖代谢等生物学过程。有研究表明，PPARα受体通路也与肿瘤发生、进展关系密切，PPARα受体激动剂被发现可抑制肺癌、结肠癌、白血病、黑色素瘤及乳腺癌等肿瘤细胞生长[1-4]。PPARα受体激动剂在肿瘤领域的研究逐渐受到重视，然而其抗肿瘤机制尚不清楚,有研究认为可能与降低三酰甘油、改善胰岛素抵抗、抗血管生成及诱导细胞凋亡等有关[5]。苯扎贝特(bezafibrate，BEZ)是目前临床常用的一种贝特类降脂药，也是一种重要的PPARα受体特异性激动剂，本研究以顺铂(cisplatin，DDP)为阳性药物，观察BEZ单用和联合DDP对人肺腺癌A549裸鼠移植瘤的抑瘤作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞 人肺腺癌细胞系A549购自中山大学细胞库，培养于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，并在37 ℃，5% CO2的环境中进行培养，0.25%胰蛋白酶消化传代备用。

1.1.2实验动物 BALB/C-NU小鼠(SPF级)24只，购自北京维通利华实验动物有限公司(NO：11400700063292)。SPF级鼠料购自广东省医学实验动物中心供应(合格证号：0082700)。鼠龄4～6周，体质量16～18 g，雄性，饲养于超净生物层流架内，温度控制在(22±3)℃，湿度控制在(50±20)%，灯光每天控制12 h开灯/12 h黑暗循环。

1.1.3仪器和试剂 苏州安泰洁净工作台(SW-CJ-IFD)，倒置光学显微镜(OLYMPUS CKX41,U-CTR30-2),细胞恒温培养箱(Thermo scientific,HERACELL150i)，智能型独立通气笼IVC系统(IS7，苏杭科技器材有限公司)及流式细胞仪(Becton Dickinson，美国)。胎牛血清、RPMI-1640培养基、青霉素及链霉素等均购自Hyclone； BEZ和DDP购自美国Sigma公司。

1.2方法

1.2.1荷瘤裸鼠模型建立 将A549细胞悬液(浓度为5×107个/mL)接种于右侧腹部皮下，每鼠0.1 mL，即每鼠接种5×106个活细胞。接种后每日观察裸鼠的饮食、活动、局部红肿及溃破等情况，按规定时间测量肿瘤体积。

1.2.2实验分组及给药 当肿瘤的平均体积达到100 mm3时，开始干预治疗。24只荷瘤小鼠被随机分为4组：即对照组(生理盐水)、BEZ组(200 mg/kg BEZ)、DDP组(2 mg/kg DDP)及联合组(200 mg/kg BEZ+2 mg/kg DDP)，每组6只。DDP采用腹腔注射，BEZ采用灌胃方法，每天1次，持续3周。 实验期间注意观察裸鼠精神状况、进食、排便及体质量情况，实验3周后处死小鼠。

1.2.3移植瘤体积测量 每3天称量小鼠体质量1次，用游标卡尺测量皮下移植瘤的长径(a)和 短径(b)，并按公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)=[长度(mm)×宽度(mm)2]/2

1.2.4移植瘤质量和抑瘤率测定 实验3周后，以颈椎脱位方式处死各组裸鼠，完整剥离肿块，去除血污、脂肪等非瘤组织,称取瘤体质量，并计算肿瘤生长抑制率(IR)：IR(%)=(1-实验组平均质量/对照组平均质量)×100%

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡 取新鲜移植瘤组织，置于8 mL冰磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液中，用剪刀剪碎及充分匀浆， 以350目尼龙网过滤，制成细胞悬液。 1 500 r/min离心5 min后，去除上清液，收集细胞，以70%的乙醇固定，置于4 ℃冰箱保存。 按项目前期研究及试剂盒的说明进行凋亡检测[6]，加入5 μL的膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和5 μL的碘化丙啶(PI)， 4 ℃避光反应30 min后， 采用流式细胞仪进行细胞凋亡检测，实验重复 3 次，计算总体凋亡细胞的比例。

1.2.6实时荧光定量反转录PCR(RT-qPCR)检测 取肿瘤组织加入1 mL Trizol，冰浴充分研磨后，吸取组织匀浆液于4 ℃、3 000 r/min 条件下离心 15 min， 取上清液 。RT-qPCR扩增条件如下：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s，进行40次循环。NF-κB1上游引物：5′-CCA CCC GGC TTC AGA ATG G-3′，下游引物：5′-GGT ATG GGC CAT CTG CTG TT-3′；白细胞介素(intedeukin,IL)-6上游引物：5′-TGC AAT AAC CAC CCC TGA CC-3′，下游引物：5′-GTG CCC ATG CTA CAT TTG CC-3′；诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)上游引物：5′-TGA ACT ACG TCC TGT CCC CT-3′，下游引物：CTC TTC TCT TGG GTC TCC GC-3′；环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)上游引物：5′-GTT CCA CCC GCA GTA CAG AA-3′，下游引物：5′-AGG GCT TCA GCA TAA AGC GT-3′；β-actin上游引物：5′-GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG-3′，下游引物：5′-GTC ACC TTC ACC GTT CCA GT-3′。按公式2-ΔΔCt计算各基因的相对表达水平，实验重复3次。

2 结 果

2.1BEZ及其联合DDP对肺癌移植瘤的抑瘤作用 裸鼠皮下接种A549细胞悬液约5 d后，皮下可见肿瘤形成，20 d左右肿瘤体积达100 mm3。裸鼠的饮食和活动正常，局部无异常红肿及溃破等情况,给药前各组移植瘤体积比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组裸鼠的移植瘤体积随时间增加不断增大，但药物干预治疗组移植瘤体积增加缓慢，呈不同程度生长抑制。DDP组在用药第9～21天对移植瘤的生长具有明显抑制作用，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；BEZ抑瘤作用起效较慢，在用药15 d后其移植瘤体积与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；联合组抑瘤作用最明显，肿瘤体积增加最为缓慢，用药第12～21天与BEZ或DDP组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。各实验组均不同程度抑制移植瘤的生长，BEZ和DDP组抑瘤率分别为27.69% 和38.46%，各实验组间抑瘤率比较差异有统计学意义(P<0.05)，特别是联合组抑瘤作用最明显，抑瘤率达52.30%，与BEZ或DDP组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与BEZ、DDP组比较

图1各组裸鼠肺癌A549细胞移植瘤体积比较

2.2BEZ及其联合DDP对裸鼠移植瘤细胞凋亡影响 采用流式细胞技术检测各处理组细胞凋亡情况，实验结果显示，BEZ可诱导裸鼠移植瘤细胞凋亡，其肿瘤细胞凋亡率为(11.74±1.21)%，与对照组(4.37±0.52%)比较，差异有统计学意义(P<0.05)。 BEZ能增强DDP的凋亡诱导作用，联合组凋亡率为(43.24±4.83)%，与BEZ组[(11.74±1.21)%]、DDP组[(29.56±2.50)%]比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

表1 各组平均瘤质量与抑瘤率比较(n=6)

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与联合组比较

a：P<0.05,与对照组比较;b:P<0.05,与BEZ、DDP组比较

图2各组裸鼠移植瘤细胞凋亡比较

2.3BEZ及其联合DDP对移植瘤炎症因子表达影响 通过RT-qPCR检测裸鼠移植瘤组织中相关炎症相关因子表达，结果表明，BEZ能有效抑制移植瘤组织中IL-6、iNOS及COX-2 mRNA的表达水平，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。BEZ联合DDP对IL-6、iNOS及COX-2 mRNA的表达产生明显抑制作用，与对照组比较，联合组裸鼠IL-6和iNOS mRNA的表达下调约3倍，COX-2 mRNA的表达下调约2倍。此外，BEZ也一定程度抑制NF-κB1基因的表达，但与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

a：P<0.05,与对照组比较；b：P<0.05,与BEZ组比较

图3各组裸鼠移植瘤组织中炎症因子表达水平比较

3 讨 论

PPARα受体通路与肿瘤发生关系密切，已有研究发现，多种人类肿瘤细胞上均不同程度表达PPARα受体,PPARα激活剂已被证实对多种人类肿瘤，包括肝癌，黑色素瘤及子宫内膜癌等肿瘤具有抗癌作用[1-5]。BEZ属于PPARα激活剂，广泛应用于临床降脂治疗，对控制动脉粥样硬化、心血管疾病、缺血再灌注损伤等有较好疗效。本课题组前期研究表明，BEZ可有效抑制肺腺癌细胞的生长和诱导肺腺癌A549细胞凋亡，其机制可能与下调血管内皮生长因子(VEGF)和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达有关，并且BEZ联合DDP对肺癌细胞的生长具有协同抑制效应[7]。为探讨BEZ或联用DDP的体内抗肺腺癌，本研究通过肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤模型，观察BEZ及联用DDP的体内抑瘤效应，结果表明，与阳性药物DDP比较，BEZ体内抑瘤较弱，但仍可有效抑制裸鼠移植瘤的生长，其抑瘤率为27.69%；当BEZ联用DDP时，可产生明显的抑瘤作用，其抑瘤率达到52.30%，提示BEZ联用DDP可能产生协同抗肿瘤作用，此与本项目前期体外研究相吻合[7]。近年来的研究发现，PPARα激活剂(包括BEZ)对非小细胞肺癌原发癌和转移癌均具有较好的抑制作用[8]。此外，临床研究也发现，BEZ可改善白血病患者的疗效，表明BEZ等PPARα激活剂可能在肺癌等肿瘤治疗领域具有较好的应用前景[9]。

PPARα抗肿瘤作用的确切机制仍不清楚。有研究表明，PPARα激活剂的抗肿瘤作用认为可能与改善胰岛素抵抗、抗血管生成、抗炎及诱导细胞凋亡等有关[1-5]。诱导肿瘤细胞凋亡是许多抗癌药物抑制肿瘤生长的重要机制。文献报道，PPARα激活剂可通过多种机制诱导细胞凋亡，发挥抗癌作用。例如PPARα激活剂非诺贝特诱导肿瘤细胞的凋亡可能与抑制NF-κB功能、上调叉头转录因子O3a(FOXO3a)表达及抑制线粒体呼吸链功能而上调活性氧(ROS)等有关[10]。本研究结果表明，BEZ可诱导移植瘤细胞凋亡，并且当BEZ联合DDP后，细胞凋亡诱导作用明显增强，细胞凋亡率达到(43.24±4.83)%，表明细胞凋亡诱导可能是BEZ发挥抗肺癌作用机制之一。本研究也观察到BEZ也可抑制NF-κB1基因的表达，但抑制作用较弱，而联合DDP后，NF-κB1基因表达下调较明显。BEZ是否通过干扰NF-κB功能而发挥细胞凋亡诱导作用，此需要进一步深入研究。

肿瘤炎症微环境的形成与肿瘤的发生及进展关系密切，炎症因子介导的信号通路参与了肿瘤细胞的恶性演进，因此抑制肿瘤微环境中的细胞因子或炎症因子可产生良好的抗肿瘤效应。NF-κB是调节炎性反应的重要因子，可调节IL-1、IL-6等多种细胞因子的表达，在炎症反应方面起着重要作用[11]。IL-6是炎症网络的核心因子，主要参与肿瘤的生长、转移、分化、血管生成和微环境免疫调节等过程。此外，肿瘤炎症微环境中iNOS和COX-2高表达与活化，也参与与血管生成、炎症及肿瘤的发生、发展和转移等过程[12-13]。现有研究表明，多种PPAR-α激动剂具有良好的抗炎作用，例如非诺贝特可通过多种机制发挥抗炎作用，其抗炎作用可能与抑制NF-κB活性、抑制多种IL分泌(例如IL-2、IL-6、IL-4、IL-5等)及下调COX-2和iNOS的表达等有关[8,10，14]。本研究结果发现，BEZ可降低移植瘤组织中炎症因子IL-6、iNOS及COX-2 mRNA的表达水平，特别是，与DDP联用可产生更强的抗炎作用，提示BEZ可能通过抑制肿瘤微环境中IL-6、iNOS及COX-2等细胞因子的表达，从而产生抗肿瘤作用。BEZ的细胞凋亡诱导作用是否与BEZ的上述抗炎作用相关，需要进一步研究。NF-κB为一个转录因子蛋白家族，由Rel(cRel)、p65(RelA,NF-κB3)、RelB、p50(NF-κB1)和p52(NF-κB2)等5个亚单位组成。本研究结果显示，BEZ对NF-κB1基因的表达抑制作用较弱，但该药是否对NF-κB其他亚单位的表达和活性产生影响，BEZ是否通过NF-κB途径抑制IL-6等炎症因子表达，均需要进一步证据。

综上所述，BEZ可有效抑制A549细胞裸鼠移植瘤的生长，当与DDP联合应用时，产生更强的抗肿瘤用，提示PPARα受体可能是新的肺癌治疗靶点。贝特类药物如BEZ，由于其具有的良好耐受性和不良反应小等优点，若能与DDP等一线肺癌治疗药物联用产生协同抗肿瘤作用，则具有重要临床意义。