土壤真菌Curvularia affinis HS-FG-196抗肿瘤化学成分的再研究

2019-05-30陈丽君张宝新张杭锋王继栋

天然产物研究与开发 2019年5期

陈丽君，张宝新，张杭锋，张辉*，王继栋

1 台州市立医院西药房； 2 浙江省抗真菌药物重点实验室浙江海正药业股份有限公司，台州 318000

棘壳孢素(pyrenocines)是1979年Sato,H.等人从洋葱粉色根腐病菌(Pyrenochaetaterrestris)分离得到的植物毒素，他们从中得到pyrenocines A和B[1]，同年申请了pyrenocines A和B的专利，保护了其制备方法及作为植物生长抑制剂的用途[2]。但是在后续的研究中，他们发现其结构被鉴定错误，Sato,H.等人1981年通过单晶衍射确定了其结构[3]。在对P.terrestris次级代谢产物的进一步研究中，Sato,H.等人首次从该菌的次级代谢产物中发现的另一类新的植物毒素—棘壳孢酸(pyrenochaetic acids)，他们从中分离得到pyrenochaetic acids A，B 和C，并报道了其之间的相互转化及对植物生长的抑制作用[4]。这类化合物后续报道较少，但是pyrenocines类化合物被大量发现，如pyrenocines C-R等[5-9]，同时这类化合物的生物活性也得到了更大的发掘。Pyrenocines除具有抑制植物生长的植物毒素作用外还具有抗菌、抗真菌、抗锥体虫、抗疟乃至细胞毒素活性[6]，其丰富的生物活性决定其具有很好的研究价值及开发潜力。

在前期研究中[10]，我们从土壤真菌CurvulariaaffinisHS-FG-196中分离得到两个新化合物pyrenocine J、pyrenochaetic acid D和两个已知化合物pyrenocine A，pyrenochaetic acid A。本文对土壤真菌CurvulariaaffinisHS-FG-196的代谢产物进行了进一步的研究，分离得到六个单体化合物pyrenocine S(1)、pyrenocine B(2)、pyrenocine E(3)、pyrenocine I(4)、pyrenochaetic acid B(5)和pyrenochaetic acid C(6)。化合物1～6的化学结构见图1。本文报道了化合物1～6的结构鉴定及其体外抑制肿瘤细胞株A549、HCT-116、ACHN、K562和HepG2的活性。

图1 Pyrenocine A,Pyrenocine J,Pyrenochaetic acid A,Pyrenochaetic acid D和化合物1～6的结构式Fig.1 Structures of Pyrenocine A,Pyrenocine J,Pyrenochaetic acid A,Pyrenochaetic acid D and compounds 1-6

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

50 L发酵罐(上海国强生化工程装备公司)； MULTIFUGE X3离心机(美国Thermo公司)；Agilent 1100型高效液相色谱(HPLC)仪，半制备ODS反相色谱柱(250 mm×9.4 mm)(美国Agilent公司)；Bruker-AVANCE400型核磁共振(NMR)仪(德国Bruker公司)；Thermo Finnigan-LCQ Advantage质谱(MS)仪(美国Thermo公司)；M5酶标仪(美国Molecular Devices公司)。

1.1.2 试剂

Doxorubicin(>99%，浙江海正药业股份有限公司)；RPMI-1640 和DMEM/F-12 1∶1培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(生工生物工程有限公司)；胰酶(国药集团化学试剂有限公司)；PBS(美国GiBco公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒(DojinDo Laboratories)；DMSO(上海凌峰化学有限公司)；分析用甲醇、氯仿、乙醇、丙酮等购自国药集团化学试剂有限公司；色谱用甲醇、乙腈购自美国Fisher公司。

1.2 培养基

1.2.1 斜面培养基

马铃薯200 g(去皮，切成小块，加水煮沸30 min，4～6层纱布过滤，收集滤液)，葡萄糖20 g，琼脂20 g，用水定容至1 000 mL，120 ℃高压灭菌 20 min。

1.2.2 种子培养基

土豆淀粉30 g，葡萄糖 40 g，蛋白胨 4 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO42 g，用水定容至1 000 mL，120 ℃高压灭菌 20 min。

1.2.3 发酵培养基

土豆淀粉(1.0%)，葡萄糖(0.4%)，蛋白胨(0.2%)，酵母提取物(0.2%)，MgSO4(0.2%)，CaCl2(0.1%)，pH 7.8，高压灭菌 20 min。

1.3 菌株

产生菌由山东农业大学张天宇教授提供。2006年，该菌株由山东农业大学硕士研究生张伟分离自吉林省白河市土豆地土壤，并鉴定其为C.affinis(菌株编号为HSAUP044489)。[11]目前，该菌株保存在浙江海正药业股份有限公司中央研究院，菌种鉴定保藏室，菌株编号为HS-FG-196。

1.4 细胞株

人肺癌细胞株A549，人肝癌细胞株HepG2，人宫结肠癌细胞株HCT-116，人肾癌细胞株ACHN和白血病细胞K562均购自武汉大学。

2 实验方法

2.1 菌株发酵

取保存的菌株斜面，挑取适量菌丝或孢子，接种至斜面培养基上，于28 ℃，活化培养5天。将斜面培养物接入种子培养基，温度30 ℃，于250 rpm摇床上培养约4天，然后将种子液按照10%的接种量接入装有30 L发酵培养基的50 L发酵罐中，温度28 ℃，通气量1 m3·h-1，转速100 rpm，发酵周期为7天，最后得到发酵液30 L。

2.2 提取与分离

30 L发酵液经过离心得到菌丝体及上清液。其中菌丝体用5.0 L甲醇(MeOH)浸泡过夜，过滤得甲醇提取液；上清液上Diaion HP-20树脂柱，上完样后先用水洗涤，然后用95%乙醇(EtOH)洗脱，并收集乙醇洗脱液。合并所得甲醇提取液及乙醇洗脱液，在45 ℃减压浓缩至干，得到总浸膏55.0 g。

总浸膏经硅胶柱层析(100～200目)，以CHCl3/ CH3OH(90∶10～50∶50)梯度洗脱，分别收集流分。各流分经过薄层层析检测，合并得到3个部分Fraction-1，Fraction-2和 Fraction-3。再将每部分经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，得到对应的三个组分Subfraction-1，Subfraction-2，和Subfraction-3。此3个组分再用半制备高压液相(semi-preparative HPLC)进行反相色谱分离，最后得到单体化合物。其详细步骤如下：

Subfraction-1在以下条件进行反相色谱分离：洗脱剂(MeCN∶H2O=45∶55)，流速(1.5 mL/min)，检测波长(λ= 254 nm)，收集保留时间为15.6 min的峰得到化合物1(15.7 mg)；收集保留时间为6.1 min的峰，然后其再经过下列色谱条件进行纯化 (洗脱剂(MeCN∶H2O=35∶65)，流速(1.5 mL/min)，检测波长(λ= 254 nm)(，收集保留时间为17.1 min的峰得到化合物3(7.6 mg)。

Subfraction-2在以下条件进行反相色谱分离：洗脱剂(MeCN∶H2O=50∶50)，流速(1.5 mL/min)，检测波长(λ= 254 nm)，收集保留时间为16.5 min的峰得到化合物6(11.7 mg)；收集6.6～8.7 min的峰，然后经过下列色谱条件进行纯化 (洗脱剂(MeCN∶H2O=25∶75)，流速(1.5 mL/min)，检测波长(λ= 254 nm)(，收集保留时间为11.7 min的峰得到化合物2(55.0 mg)，收集保留时间为13.5 min的峰得到化合物4(4.3 mg)。

Subfraction-3在以下条件进行反相色谱分离：洗脱剂(MeCN∶H2O=40∶60)，流速(1.5 mL/min)，检测波长(λ= 254 nm)，收集保留时间为8.6 min的峰得到化合物5(5.6 mg)。

2.3 体外抗肿瘤试验

采用CCK8法测试所得化合物体外抑制A549、HCT-116、ACHN、K562和HepG2等肿瘤细胞株的活性。实验流程参照已发表的文献[12,13]。

3 结果

3.1 分离所得单体化合物性状与结构鉴定

红外光谱显示化合物1是一个α-吡喃酮类的化合物。将化合物1的核磁数据与已知化合物pyrenocine E的核磁数据[5]进行比较，结果显示化合物1与pyrenocine E只是在C-3′位的一个连接基团不一样，他们具有相似的结构。pyrenocine E在C-3′位连接的是一个甲氧基(δH3.27,δC56.20)而化合物1连接的是一个乙氧基(δH3.36/3.57,δC64.0 和δH1.14,δC15.5)。通过1H-1H COSY,HMQC 和HMBC等2D NMR波谱可以进一步证明上述结果。在HMBC谱图中(图2)，H-3(δH5.49)与C-2，C-4和C-5，4-OCH3(δH3.87)与C-4及6-CH3(δH2.28)与C-5和C-6的相关性表明化合物1具有和pyrenocine E一样的4-甲氧基-6-甲基-α-吡喃酮母核。1H-1H COSY谱图中(图2)3′-OCH2CH3′δH3.36,3.57)和3′-OCH2CH3′δH1.14)，H-3′(δH3.96)与H-4′(δH1.21)和H-2′(δH2.97,2.75)的相关性及HMBC谱图中(图2)H-3′和C-3′-OCH2CH3(δC64.0)，H-3′-OCH2CH3(δH3.36,3.57)和C-3′(δC71.9)，H-4′和C-2′(δC51.8)进一步确定了化合物1的结构，如图2所示。

图2 化合物1的1H-1H COSY和HMBC相关图Fig.2 1H-1H COSY and HMBC correlations of new compound 1

通过1H-1H COSY,HMQC 和HMBC等2D NMR波谱分析，对该化合物的全部碳信号和氢信号进行了归属(表1)。经SciFinder网络检索，未发现相关报道，表明这是一个新的pyrenocines类化合物，我们将其命名为pyrenocine S。

化合物2白色固体(CHCl3)；1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:5.50(1H,s,H-3),4.31(1H,s,H-3′),3.88(3H,s,H-4-OCH3),2,91 dd(1H,J=17.4,3.3 Hz,H-2′a),2.82 dd(1H,J=17.4,8.6 Hz,H-2′b),2.28(3H,s,H-6-CH3),1.24(3H,d,J=6.4 Hz,H-4′);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:163.8(s,C-2),87.8(d,C-3),168.3(s,C-4),56.5(q,C-4-OCH3),115.5(s,C-5),162.4(s,C-6),18.6(q,C-6-CH3),201.0(s,C-1′),52.8(t,C-2′),64.3(d,C-3′),22.8(q,C-4′);ESI-MS:m/z227 [M + H]+。以上数据与文献[1,3]报道一致，鉴定化合物2为pyrenocine B。

表1化合物1的氢谱和碳谱

Table 11H(400 MHz)and13C(100 MHz)NMR data of new compound1in CDCl3

No.13C1H(ppm,J in Hz)2162.7 s-387.6 d5.49 s(1H)4168.4 s-4-OCH356.4 q3.87 s(3H)5116.0 s-6163.5 s-6-CH318.4 q2.28 s(3H)1′199.4 s-2′51.8 t2.97 dd(1H,16.0,8.3)2.75 dd(1H,16.0,4.7)3′71.9 d3.96 m(1H)3′-OCH2CH364.0 t3.57 m(1H);3.36 m(1H)3′-OCH2CH315.5 q1.14 t(3H,7.0)4′19.6 q1.21 d(3H,6.2)

化合物3白色固体(CHCl3)；1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:5.48(1H,s,H-3),3.86(3H,s,H-4-OCH3), 3.83(1H,m,H-3′), 3.27(3H,s,H-3′-OCH3),2.94 dd(1H,J=16.0,8.3 Hz,H-2′a),2.74 dd(1H,J=15.9,4.7 Hz,H-2′b),2.25(3H,s,H-6-CH3),1.19(3H,d,J= 6.1 Hz,H-4′);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:163.5(s,C-2),87.6(d,C-3),168.4(s,C-4),56.4(q,C-4-OCH3),115.9(s,C-5),162.6(s,C-6),18.3(q,C-6-CH3),199.4(s,C-1′),51.6(t,C-2′),73.7(d,C-3′),56.2(q,C-3′-OCH3),18.9(q,C-4′);ESI-MS :m/z241[M + H]+。以上数据与文献[5]报道一致，鉴定化合物3为pyrenocine E。

化合物4白色固体(CHCl3)；1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:6.23(1H,d,J= 16.1 Hz,H-1′), 5.98(1H,dd,J= 16.1,6.0 Hz,H-2′),5.48(1H,s,H-3),4.45(1H,s,H-3′),3.83(3H,s,H-4-OCH3),2.32(3H,s,H-6-CH3),1.36(3H,d,J= 6.4 Hz,H-4′);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ: 163.8(s,C-2),87.8(d,C-3),170.2(s,C-4),56.1(q,C-4-OCH3),110.1(s,C-5),163.8(s,C-6),18.4(q,C-6-CH3),118.4(d,C-1′),139.9(d,C-2′),69.0(dzhuzhu,C-3′),23.5(q,C-4′);ESI-MS:m/z211 [M + H]+。以上数据与文献[6]报道一致，鉴定化合物4为pyrenocine I。

化合物5白色固体(CHCl3)；1H NMR(CD3SOCD3,400 MHz)δ:13.14(1H,s,H-1-COOH),7.44(1H,s,H-6),7.40(1H,s,H-2),4.08(1H,m,H-3′),3.84(3H,s,H-3-OCH3),2.20(3H,s,H-5-CH3),2.82(2H,m,H-2′),1.12(3H,d,J=6.2 Hz,H-4′);13C NMR(CD3SOCD3,100 MHz)δ: 135.0(s,C-1),167.2(s,C-1-COOH),109.7(d,C-2),156.3(s,C-3),56.3(q,C-3-OCH3),132.6(s,C-4),136.0(s,C-5),18.9(q,C-5-CH3),124.3(d,C-6),206.0(s,C-1′),53.9(t,C-2′),63.3(d,C-3′),24.2(q,C-4′);ESI-MS:m/z251[M-H]-。以上数据与文献[4]报道一致，鉴定化合物5为pyrenochaetic acid B。

化合物6白色固体(CHCl3)；1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:11.06(1H,br s,H-1-COOH),7.59(1H,s,H-6),7.47(1H,s,H-3),3.87(3H,s,H-3-OCH3),2.75(2H,m,H-2′),2.27(3H,s,H-5-CH3),1.73(2H,m,H-3′),0.99(3H,t,J=7.4 Hz,H-4′);ESI-MS:m/z235 [M-H]-。以上数据与文献[4]报道一致，鉴定化合物6为pyrenochaetic acid C。

3.2 体外抗肿瘤活性

以A549、HCT-116、ACHN、K562和HepG2肿瘤细胞株为模型，用CCK-8法对本菌所得化合物1～6、pyrenocine J、pyrenochaetic acid D、pyrenocine A和pyrenochaetic acid A的细胞毒活性进行了初步评价，结果显示化合物1、2、3、pyrenocine A和pyrenochaetic acid A对肿瘤细胞A549、HCT-116、ACHN、K562和HepG2表现出较强的活性；其余化合物对上述肿瘤细胞表现出较弱的活性。活性结果见表2。

4 讨论

本文对一株分离自土豆根部的土壤真菌C.affinisHS-FG-196的次级代谢产物进行了再研究，共分离得到六个单体化合物(1～6)，利用各种波谱学方法结合理化性质分析鉴定了所有化合物的结构，其中化合物1为新化合物。在对其进行抗肿瘤活性评价中，我们发现化合物1、2、3、pyrenocine A和pyrenochaetic acid A对肿瘤细胞A549、HCT-116、ACHN、K562和HepG2表现出较强的活性；化合物4～6、Pyrenocine J 和Pyrenochaetic acid D对上述肿瘤细胞表现出较弱的活性。在具有相同母核条件下，化合物活性相差较大，因此，化合物抗肿瘤活性与其侧链关系紧密。其中pyrenocines A和pyrenochaetic acid A的侧链(E)-but-2-en-1-one与globosumone A的侧链[14]非常相似，而且他们的活性强于其各自具有相同母核的化合物[14-16]。因此，我们推测(E)-but-2-en-1-one是一个抗肿瘤活性官能团。