紫锥菊提取物及酚酸化合物体外抗血小板聚集活性研究

齐海艳，陈新蕊，王诗寒，杜 妍，裴月湖,*，甘春丽*

1沈阳药科大学中药学院，沈阳110016；2哈尔滨医科大学药学院，哈尔滨 150081

随着现代社会的发展和人口老龄化进程的加快，血栓性疾病[1]已成为严重危害人类生命健康的头号疾病，常见的如心绞痛 、心肌梗死、脑梗死、血栓性静脉炎等，而且日趋严重。治疗和干预血栓性疾病成为当代医学研究的重点和热点之一，其病因及发病机制十分复杂，尚未完全阐明。目前认为血小板聚集[2]是引起血栓性疾病关键因素之一。到现在为止，国际上预防和治疗血栓的常用药物包括抗血小板药物，如阿司匹林；抗凝血药物，如华法林等；纤维蛋白溶解药物，如尿激酶(UK)等。

紫锥菊(Echinaceapurpurea(L.) Moench)也称“松果菊”，为菊科(Compositea)松果菊属(Echinacea)多年生草本植物，原产于北美洲，已在我国引种成功[3]。紫锥菊提取物具有抗炎、抗病毒、免疫调节、抗癌、抑制念球菌感染、预防光照损伤皮肤等作用[4]。目前还有药理研究表明[5,6]，紫锥菊中酚酸类化合物具有不同程度的抗血小板聚集的活性。紫锥菊中的菊苣酸等成分其抗血栓作用至今没有研究报道。

目前对抗血栓的研究主要采用的是经典的体外抗凝血及抗血栓方法[7-12]，以血浆复钙时间、凝血酶时间、体外血栓溶解率及全血凝块容积率为指标，考察化合物体外抗凝血与抗血栓的活性。由于在体内凝血过程中，需要血小板和一系列凝血因子的共同参与，血小板为凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅸa、Ⅹa提供了磷脂表面，在Ca2+参与下激活凝血酶原激活物，进而激活凝血酶，完成凝血过程。在此基础上，本实验采用了Born比浊法[13,14]研究10个酚酸类化合物以及紫锥菊提取物体外抗ADP诱导的血小板聚集作用，并应用了分子对接的方法[15,16]，将酚酸类化合物与凝血因子进行对接。实验旨在研究紫锥菊酚酸类化合物及其提取物体外抗血小板聚集活性以及酚酸类化合物与凝血因子的虚拟分子对接，为紫锥菊提取物体内抗血小板聚集活性的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

雄性SD大鼠(动物许可证号：SCXK(辽)2015-0001)，体重220 ± 10 g，动物适应性饲养一周，温度21± 2 ℃，湿度40%～45%，自由摄食和饮水，由沈阳药科大学动物中心提供。

1.1.2 试剂与药品

乙醇(分析纯，天力化学有限公司)；戊巴比妥钠(分析纯，阿拉丁试剂有限公司)；枸橼酸钠(分析纯，阿拉丁试剂有限公司)；阿司匹林(ASA)(分析纯，阿拉丁试剂有限公司)；二甲基亚砜(DMSO)(分析纯，富宇精细化工有限公司)；紫锥菊药材粗粉(益康中药堂)；4,5-腺苷二磷酸二钠盐(ADP)(分析纯，美国sigma公司)。

化合物S-1～S-10均由本实验室前期合成所得[17]，经过TLC、MS、1H NMR、13C NMR鉴定(如表1所示)。

表1 10个酚酸类化合物的化学名称及其结构

续表1(Continued Tab.1)

编号Number名称Name结构 StructureS-8咖啡酸甲酯Methyl caffeateS-9咖啡酸乙酯Ethyl caffeateS-10绿原酸Chlorogenic acid

1.1.3 仪器与材料

HHS型电热恒温水浴锅(博讯实业有限公司医疗设备厂)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；LC-400低速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；HC-2518R高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；LG-KOALA血小板凝集仪(北京Steellex科学仪器公司)；AGBP210S电子天平(德国Satorius公司)。

1.2 方法

1.2.1 富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)的制备

未给药雄性SD大鼠，给予戊巴比妥钠 (50 mg/kg，i.p.0.08 mL/100 g)进行麻醉，右侧颈动脉取血5 mL，采用3.8%枸橼酸钠抗凝，全血与3.8%枸橼酸钠水溶液比例为9∶1(v/v)混合。800 rpm离心10 min，取上层血浆，得到PRP，3 000 rpm继续离心10 min，取上层血浆，得到PPP。

1.2.2 供试品溶液的制备

取合成的酚酸类化合物S-1～S-10及ASA对照品适量，精密称量，DMSO溶解，配制成2、20、200 μmol/L的样品溶液,作为供试品溶液。

紫锥菊药材粗粉10 g加入50 mL 60%乙醇回流提取三次，每次30 min，合并提取液，浓缩，用DMSO溶解，配制成每1 mL含1 g的生药储备液，稀释成100、50、10 mg/mL三个浓度梯度，测定前用0.45 μm滤膜过滤，续滤液即为供试品溶液。

1.2.3 体外抗血小板聚集实验

将290 μL PRP加入比浊杯中，放入搅拌珠，分别加入5 μL DMSO以及供试品溶液，于37 ℃预温口内预温1 min，之后加入ADP 5 μL(终浓度5 μmol/L)，37 ℃搅拌5 min，记录最大血小板聚集率。以DMSO溶液作为空白对照溶液，以ASA溶液作为阳性对照溶液。

1.3 数据处理

血小板聚集百分率及聚集抑制百分率计算公式如下：

聚集率(%)=(PPP透光度-PRP聚集透光度)/PPP透光度×100%

聚集抑制率(%)=(溶剂对照组聚集率-给药组聚集率)/溶剂对照组聚集率×100%

采用SPSS 13.0统计软件对聚集抑制率进行线性相关分析，P<0.05表示差异有统计学意义，实验数据取三次独立实验数据的平均值。

采用Sigma Plot线性回归方程计算供试品的半数抑制浓度(50% inhibitory concentration,IC50)，结果以x±SD表示。

1.4 酚酸类化合物与凝血因子分子对接

采用Discovery Studio 3.5以及RCSB Protein Data Bank 数据库在建立对接体系的基础上模拟10种酚酸类化合物与凝血因子F5、F8、F11分子间的结合键和对接能。

2 结果

2.1 紫锥菊及其酚酸类化合物体外抗ADP诱导血小板聚集活性

2.1.1 紫锥菊提取物体外抗血小板聚集活性

线性相关分析相关系数r=0.89，t=4.344 5(P<0.05)，紫锥菊提取物浓度与聚集抑制率存在线性相关关系。紫锥菊60%乙醇提取物对体外ADP诱导的血小板聚集有抑制作用，抑制率呈浓度依赖性(见表2)。

2.1.2 酚酸类化合物外抗ADP诱导血小板聚集活性

体外实验结果显示：化学法合成的酚酸类化合物均具有抗ADP诱导的血小板聚集活性，其中3个化合物抗血小板聚集的作用与ASA抗血小板聚集的作用相近，实验结果见表3。

表2 紫锥菊提取物体外抗ADP诱导的血小板聚集活性(n=3)

注:与阳性对照相比，P<0.05。

Note:Ratio of positive control,P<0.05.

表3酚酸类化合物体外抗ADP诱导的血小板聚集活性(n=3)

Table 3 Effects of phenolic compounds on the platelet aggregations induced by adenosine diphosphate (ADP)invitro(n=3)

化合物Compound半数抑制浓度IC50 (μmol/L)(x ± SD)化合物Compound半数抑制浓度IC50 (μmol/L)(x ± SD)ASA8.2 ± 0.1S-615.6 ± 1.3S-19.2 ± 1.2S-714.4 ± 2.1S-210.3 ± 0.8S-825.2 ± 2.2S-311.1 ± 1.5S-919.8 ± 1.9S-416.2 ± 0.9S-1013.7 ± 0.6S-522.7 ± 0.4

注:与阳性对照相比，P<0.05。

Note:Ratio of positive control,P<0.05.

2.2 酚酸类化合物与凝血因子分子对接

2.2.1 酚酸类化合物与F5蛋白对接

酚酸类化合物以及阳性药，分别与F5蛋白在相同的条件下进行分子对接，得到对接结果(见图1)以及对接评估数据(见表4)。

图1 酚酸类化合物与F5分子的对接结果Fig.1 Molecular docking results of phenolic compounds and F5

以D-苯丙氨酸-N-[(2S,3S)-6-{[氨基(亚胺基)甲基]氨基}-1-氯-2-羟基己酸-3-基]-l-脯氨酰胺[18]作为阳性药，与F5进行分子对接，结果显示化合物可以全部进入到活性位点。阳性药与活性位点氨基酸Asp562(1个)、Gly566(1个)、Ser568(1个)、Ser589(1个)以及Gly591(2个)可以形成6个氢键，具体见表4。同时化合物的化学结构位于整个活性位点，使得阳性药与F5蛋白紧密结合在一起，具体见图2。

图2 F5与Positive分子对接结果分析Fig.2 Evaluation of docking results of Positive and F5注：a.左侧为化合物与活性位点的结合方式；b.右侧为影响结合的因素：绿色虚线表示氢键，橘黄色表示共价键。Note:a.The combination of the Positive and the active site;b.Factors for binding:green represents hydrogen bond,orange is covalent bond.

比较化合物与阳性药的对接结果，化合物S-6对F5的作用要比阳性药好，原因是化合物S-6化学结构位于整个活性位点，且与活性位点氨基酸Trp455(1个)、Asp562(2个)、Ser589(1个)及Gly591(2个)形成6个氢键，使得S-6与F5蛋白紧密结合(见图3,表4)。

图3 F5与S-6分子对接结果分析Fig.3 Evaluation of docking results of S-6 and F5

表4 化合物S-6和阳性对照药分别与F5形成氢键的氨基酸及氢键数目

注：-：无氢键；+：1个氢键；++：2个氢键

Note:-:no hydrogen bond;+:1 hydrogen bond;++:two hydrogen bonds

表5 酚酸类化合物与F5对接结果评价

化合物S-2、S-4、S-7、S-8、S-10与F5结合的能力要高于与阳性药结合能力的50%，而S-1、S-3、S-9的结合能力较小(见表5)，结合的氢键情况见表6。

表6 酚酸类化合物与F5形成氢键的氨基酸及氢键数目

2.2.2 酚酸类化合物与F8,F11对接

化合物与凝血因子VIII(F8)和凝血因子XI(F11)的分子对接方法同上。F8的阳性药为(2R)-1-(2,4-苯氧基苯基)-3-[(2E)-2-亚氨基-3-(2-哌啶-1-乙基)-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-1-基]丙-2-醇[19]、F11的阳性药为6-氨基甲酰基-N-苯基-4-(嘧啶-2-氨基)萘-2-甲酰胺[20]，得到F8(图4)和F11(图5)对接结果。

图4 酚酸类化合物与F8分子的对接结果Fig.4 Molecular docking results of phenolic acid compounds and F8

由上述表和图可知，同阳性药相比较，化合物S-5和S-6与F8或者F11的作用都比阳性药强，其余药物的作用均超过阳性药的50%，尤其是S-6能够更好的与F5结合。

3 结论

在凝血过程中，凝血因子与血小板关联紧密，协同完成凝血过程。为了更好的研究酚酸类化合物的抗血栓作用，本实验进行了体外抗血小板与凝血因子的分子对接两方面研究。

表7 化合物与Coagulation factorVIII(F8)对接结果评价

表8 化合物与Coagulation factorXI(F11)对接结果评价

图5 酚酸类化合物与F11分子的对接结果Fig.5 Molecular docking results of phenolic compounds and F11

从体外实验结果看，检测的几种天然酚酸类化合物及合成中间体都显现出了抗血小板聚集作用(略低于对照药ASA)，就半数抑制浓度IC50来说，含有游离羧基的酚酸类活性普遍好于成酯化产物，可见羧基的游离对活性是重要的。这可能与羧基和血小板聚集过程中破坏膜表面电荷有关，亦或是增加了特定靶点的结合力。

另一方面，酚羟基的存在对活性的提高作用较大，但不能得出邻二酚羟基的存在使活性可能低于单个酚羟基化合物。分析酚羟基的存在，可与过氧自由基迅速反应，避免血小板活化，是其抗血小板聚集的机制之一。

结合体外实验结果，采用分子对接方法，选择与血小板凝聚相关的蛋白(F5、F8、F11)为靶点，对这些化合物进行虚拟对接。发现S-1～S-10均可以与靶点以氢键的方式结合，其中靶点与部分化合物的相互结合能可高于与阳性对照物的50%。提示这些化合物可能参与到血小板聚集的过程中，发挥抑制作用。化合物S-6与靶点的结合位点更多，结合更紧密，结合能力更强，选择性更好，有望成为具有抗血小板聚集作用的先导物。

体外实验结果显示不能代表体内实验结果。因此，课题延续工作将围绕建立系统方法考察紫锥菊中几种天然酚酸类化合物抗血小板聚集活性，探讨作用机制，为筛选出疗效更好、副作用更小、生物利用度更高的治疗血栓栓塞性疾病药物奠定基础。

紫锥菊提取物及其酚酸类化合物在体外均显现出抗ADP诱导的血小板聚集活性，其中菊苣酸(S-6)抗血小板聚集活性较佳。分子对接研究显示菊苣酸(S-6)与凝血因子(V、VIII、XI)结合能力强于所用的三种阳性对照药，有望成为治疗血栓栓塞性疾病新药的先导化合物。