ATF5在复发鼻咽癌组织中的表达及意义

帅 煜，冯光勇，吴明娜，何国平，茍小霞，张贵海

(遵义医科大学附属医院肿瘤医院 头颈部科，贵州 遵义 563099)

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma ,NPC)是发生在鼻咽腔顶侧壁的恶性肿瘤，在东南亚尤其是中国南方较为常见，其发病率和死亡率在头颈恶性肿瘤中居首[1]。近年，鼻咽癌的局控率虽得到较大的提高，但仍有10%～36%鼻咽癌患者经适形调强放疗(Intensity-modulated radiation therapy，IMRT)±化疗后出现局部和(或)区域复发，其机制极其复杂[2]。转录激活因子5(Activating transcription factor 5 ， ATF5)属于转录因子ATF/CERB家族成员之一，涉及细胞存活、凋亡、自噬、分化等多种生物功能调节及肿瘤发展过程，在脑胶质瘤、乳腺癌、肺癌等肿瘤中呈高表达，且与肿瘤细胞的存活、迁移及放疗抵抗等有关[3]。我们曾研究发现，鼻咽癌组织ATF5蛋白表达水平与鼻咽癌临床分期呈负相关[4]，但其在复发鼻咽癌组织中的表达及临床意义尚不清楚。因此，笔者通过比较6例同一初发和复发鼻咽癌患者组织ATF5蛋白的表达水平差异及观察X线对鼻咽癌HONE-1细胞ATF5蛋白表达水平的影响，探讨ATF5表达水平与复发鼻咽癌的相关性及其可能机制，为预测鼻咽癌复发提供一定参考价值。

1 材料与方法

1.1 病例资料 收集本院病理科2010年8月至2018年1月保存的6例鼻咽癌患者初发和复发鼻咽癌组织病理标本和6例鼻咽部正常组织病理石蜡标本。所有组织标本均经10%中性福尔马林固定液固定，常规石蜡包埋，本次实验行4 μm连续切片5张待用。所有鼻咽癌标本均经病理证实为鼻咽癌，初发病例确诊前均未行任何治疗，复发病例确诊前均行规范治疗。

1.2 细胞 低分化鼻咽癌HONE-1细胞株由中山大学肿瘤防治中心惠赠。

1.3 主要试剂 兔抗人ATF5单克隆抗体购自美国Abcam公司；兔SP免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、异硫氰酸荧光素、DAPI购自北京中杉金桥生物技术有限公司；苏木素、抗体稀释液购自北京索莱宝科技有限公司；RPMI 1640培养液购自美国Hyclone公司。

1.4 细胞培养 细胞采用贴壁培养，HONE-1细胞在37 ℃、5%CO2及含10%胎牛血清、1%双抗(100 U/mL青霉素、100 U/mL 链霉素)RPMI 1640培养液中培养。采用直线加速器6 MV X射线2Gy/5f/W照射细胞(源皮距为100 cm，照射野大小为 25 cm×25 cm，培养板或瓶覆盖1.5 cm补偿膜)，存活的细胞继续培养至稳定传代再行X射线照射，如此反复，分别获得10Gy/1W、20Gy/2W、30Gy/3W、40Gy/4W、50Gy/5W HONE-1细胞株，稳定传代培养后进行试验。

1.5 免疫组织化学染色 将备好鼻咽癌组织切片脱蜡水化，置0.01M柠檬酸缓冲液(pH值6.0)进行热抗原修复，自然冷却至室温，置3% 过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，山羊血清封闭，滴加一抗(ATF5抗体，工作浓度1∶200)，4℃过夜，次日取出复温，孵育二抗(兔kit，工作浓度1∶400)，DAB显色，自来水充分冲洗，苏木素复染细胞核，常规脱水后封片，拍照。

1.6 免疫细胞化学法 制作细胞爬片，细胞密度为1×104个/孔，置培养箱过夜，次日取出，4%多聚甲醛固定细胞爬片，滴加0.5% Triton-X 100细胞通透，后续阻断内源性过氧化物酶活性、封闭、一抗孵育、二抗孵育等步骤同组织免疫组化，ATF5抗体工作浓度1∶200。

1.7 细胞免疫荧光法 取已固定细胞爬片，细胞通透、阻断内源性过氧化物酶活性、封闭步骤同免疫细胞化学法，滴加一抗(ATF5抗体，工作浓度1∶200)，4℃过夜避光，孵育Fluror 488标记山羊抗兔IgG荧光二抗，(工作浓度：1∶100)，DAPI染核，抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜观察，拍照。

1.8 结果判定 每张切片随机选择5个不同的视野(×200)显微镜下观察，免疫组化：判读染色强度和阳性细胞百分率，染色强度以多数细胞呈现的染色强度并减去背景着色计分：无明显着色为0分，浅褐色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞百分比：0%～5%评为0分，6%～25%评1分，26%～50%评2分，5l%～75%评3分，>75%均评为4分。最终癌组织阳性总得分=阳性癌细胞数百分率得分+癌细胞阳性强度得分。总分0分为阴性(-)，<4分为弱阳性(+)，4～6分为中等强度阳性(++)，6～7 分为强阳性(+++)。免疫细胞化学：用Image-Pro Plus 图像分析软件对免疫组化的图片进行分析，测量光密度(Optical density,OD)值。

2 结果

2．1 鼻咽癌组织和鼻咽正常组织ATF5蛋白表达的比较 免疫组化检测显示：鼻咽正常组织ATF5呈低表达，亚细胞定位主要于细胞浆；初发鼻咽癌组织ATF5表达水平较正常鼻咽组织表达水平显著增加，亚细胞主要定位于细胞浆，少量表达于胞核内(P<0.05)。与初发鼻咽癌组织比较，复发鼻咽癌组织ATF5表达水平显著增加(P<0.05)，且亚细胞主要定位于细胞核(见图1、表1)。

表1ATF5在鼻咽癌和鼻咽正常组织中的表达(n=6)

组织类型ATF5 表达阴性(%)弱阳性(%)中度阳性(%)强阳性(%)鼻咽正常组织 3(50)3(50)0(0)0(0) 初发鼻咽癌组织∗0(0) 1(16.67) 4(66.67) 1(16.67)复发鼻咽癌组织∗ #0(0)0(0)0(0)6(100)

与正常组织比较,*：P<0.05; 与初发鼻咽癌组织比较,#：P<0.05。

A、B:鼻咽正常组织; C、D:阴性对照组织; E、F:初发鼻咽癌组织; G、H:复发鼻咽癌组织;虚线箭头：ATF5主要定位于细胞浆;实线箭头：ATF5主要定位于细胞核(IHC A、C、E、G ×200，B、D、F、H ×400)。图1 免疫组织化学法检测鼻咽癌和正常组织ATF5蛋白的表达

2.2 X线对HONE-1细胞ATF5蛋白表达的影响 免疫细胞化学法检测结果显示：不同剂量X线(30Gy、40Gy、50Gy)能促进HONE-1细胞ATF5蛋白表达显著上调，且高剂量X线(50Gy)照射后ATF5蛋白表达水平上调更为明显(P均<0.05，见图2、表2)；ATF5在HONE-1细胞亚细胞定位也发生改变，主要表现为细胞核表达显著增加；细胞免疫荧光法检测结果也显示：HONE-1细胞ATF5蛋白主要定位于细胞核(见图3)。

表2不同X线剂量对鼻咽癌细胞ATF5IOD值影响

组别ATF5 IODHONE-130.84±6.02HONE-1 10Gy30.51±2.52HONE-1 20Gy38.95±8.27HONE-1 30Gy98.86±4.71∗HONE-1 40Gy114.45±11.61∗HONE-1 50Gy151.36±14.96∗#

与HONE-1比较,*：P<0.05; 与HONE-1 30Gy比较,# ：P<0.05。

*：P<0.05。 图2 Image-Pro Plus 软件分析X线对HONE-1细胞ATF5蛋白表达影响

A:细胞免疫组化; B：核DAPI免疫荧光染色为深蓝色; C：ATF5免疫荧光染色为绿色; D：双染色结果重叠；虚线箭头：ATF5主要定位于细胞浆；实线箭头：ATF5主要定位于细胞核,(ICC ×200，IF×200)。图3 不同剂量X线对HONE-1细胞ATF5蛋白表达影响比较

3 讨论

鼻咽癌是常见的头颈部肿瘤之一，放射治疗是其标准治疗手段。随着IMRT技术广泛运用及联合化疗的开展，鼻咽癌根治性治疗后5年局部无复发生存率(Local recurrence-free survival,LRFS)达83.0%～91.8%，区域无复发生存率(Regional recurrence-free survival,RRFS)达91.0%～96.4%[5]，但仍有10%～36%鼻咽癌患者经IMRT或联合化疗后出现局部和(或)区域复发[6]，放疗后局部复发多为高剂量区的野内复发，其主要与肿瘤的生物学因素即肿瘤克隆源性细胞放疗抵抗有关[7-8]。放疗抵抗也是鼻咽癌复发的主要机制之一，与放疗抵抗有关的因素包括细胞周期改变、抗凋亡蛋白增加、DNA损伤修复及肿瘤乏氧等。ATF5除作为正常细胞存活因子外，还能促进胶质瘤、结肠癌和肺癌等多种肿瘤细胞存活并能增加其侵袭迁移能力，同时诱导肺癌、纤维肉瘤放射抗拒性及胰腺癌对紫杉类药物耐药，具有多种致瘤作用[3]，但在肝脏细胞癌ATF5却有抑癌作用[9]。

目前，已有研究揭示了ATF5在调节细胞凋亡逃避、组织侵袭、细胞生物能失调等多种致癌作用，ATF5表达失调常见于脑胶质瘤、肺癌及胰腺癌等肿瘤[3]。课题组曾研究发现，ATF5表达水平与鼻咽癌临床分期呈负相关，与TNM分期的T分期显著负相关，与N、M分期无关[4]。本研究却发现，6例初发鼻咽癌组织ATF5表达水平较正常鼻咽组织表达水平显著增加，亚细胞主要定位于细胞浆，少量表达于胞核内，与脑胶质瘤、肺癌及胰腺癌等肿瘤ATF5表达失调一致[3]。本研究同时发现，6例局部复发鼻咽癌组织ATF5表达水平显著高于同一患者初发鼻咽癌局部组织表达水平，且ATF5亚细胞主要定位也发生改变，主要定位于细胞核，提示鼻咽癌的复发可能部分源于ATF5的高表达。另外，Ishihara等[10]研究发现了ATF5能促进肺癌放疗抵抗，且稳定转染ATF5的A549细胞对放疗也抵抗。为进一步揭示放疗与鼻咽癌细胞ATF5表达的关系，本研究又发现，随X-线照射剂量的增加，鼻咽癌HONE-1细胞ATF5蛋白表达水平也显著增高，亚细胞定位也由胞浆转至细胞核，与复发鼻咽癌组织ATF5表达亚细胞定位一致。这进一步提示ATF5表达水平增加可能促进鼻咽癌HONE-1细胞对X-线抵抗，ATF5表达上调可能与鼻咽癌复发有关。然而，关于ATF5参与放疗抵抗的机制十分复杂。有研究显示，ATF5能抑制小鼠肉瘤细胞系QRsP中p53的活性，促进其细胞衰老，使之停滞留于G1期，从而致其对放射抗性增强[11-12]。在胶质瘤中，ATF5通过ATF5特异性应答元件依赖方式激活BCL2的转录，其负性调节肽 CP-d / n-ATF5-S1通过去泛素酶Usp9x诱导BAG3，MCL1和BCL2等抗凋亡蛋白下调[13]。ATF5在乳腺癌中起抗凋亡转录因子的作用，并且siRNA沉默ATF5能降低了乳腺癌细胞的侵袭力[14]。关于ATF5表达与鼻咽癌复发及参与放疗抵抗的机制有待进一步研究。

综上所述，鼻咽癌的复发可能源于ATF5蛋白的高表达，且亚细胞定位主要于细胞核；X线能促进HONE-1细胞ATF5蛋白表达显著上调，其亚细胞定位也主要位于细胞核；提示ATF5表达变化可能与鼻咽癌放疗抵抗有关，为预测鼻咽癌复发可提供一定参考价值。