蒙药壮西-21体外对胃癌细胞生长的影响

邓秀玲 扈瑞平 李 薇 张建宇 武瑞兵 叶书梅 王海生

内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010110

在我国胃癌的发病率居各种恶性肿瘤的第二位，其异质性强，预后较差。目前对于胃癌的治疗主要采用手术、化疗和放疗三大手段，临床上常用的化疗和放疗药物，在杀伤肿瘤细胞的同时也给人体带来不同程度地损伤或不良反应[1]。临床实践表明，蒙药在抗肿瘤方面有一定的优势，如药理作用广泛，不良反应小，不易产生耐药性等[2]。

蒙药壮西-21(以下简称壮西)是由寒水石等二十一味药物组成的复方药，临床主要用于治疗消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌等消化系统疾病[3-5]。壮西抗肿瘤作用主要来自临床实践中，虽然疗效确切，但无进一步研究，特别是鲜见有从细胞、分子水平研究其作用机制的报道。本研究以体外培养的胃癌细胞为对象，观察复方蒙药壮西对胃癌细胞生长的影响。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器 蒙药壮西(内蒙古国际蒙医院)，用PBS配成50 mg/mL贮液，过滤除菌4 ℃保存备用，实验时用培养液稀释到所需浓度。胃癌MGC-803细胞(北京肿瘤研究所提供)，培养基DMEM(Gibco公司)，胎牛血清(中国医学科学院血液学研究所)，紫杉醇(四川太极制药有限公司)，Hochest33342、碘化丙啶(PI)、塞唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)(Sigama公司)。酶标仪(日本550型)，CO2恒温孵育箱(美国NAPCO)，荧光显微镜(日本，NIKON)。

1.2 细胞培养 将胃癌MGC-803细胞置于含10%胎牛血清、80 u/mL庆大霉素的DMEM培养基中，培养于37℃含5%湿饱和CO2温箱中，常规传代，取对数生长期的细胞用于实验。

1.3 细胞的活力实验 MTT法，将培养的细胞调整浓度为3×104个/mL，接种于96孔板上，每孔0.2 mL，培养24 h，弃培养液，分别加入蒙药壮西，使终浓度分别为：2.5、1.25、0.63、0.31、0.15 mg/mL。另设阴性对照组(不加药)、空白对照组(无细胞和药)、阳性对照组(紫杉醇处理组)其作用终浓度为10-6mol/L，各组设8个复孔。以上各组总体积均为200 μL。培养72 h，每孔加入20 μL 5%MTT，37 ℃温育4 h，弃培养液加DMSO200 μL，振荡10 min，酶标仪检测570 nm处吸光度OD值。按公式计算细胞生长抑制率。

抑制率=(对照组平均OD值-实验组平均OD值)/(对照组平均OD值-空白组平均OD值)×100%

1.4 细胞形态观察：壮西作用细胞48 h后，采用荧光双染法观察细胞形态变化。取1×106个细胞离心，经PBS洗涤2次，重悬于200 μL PBS中，分别加25 μL荧光染料Hoechst 33342和PI。37 ℃温育8～10 min，离心洗涤后滴片，于荧光显微镜下观察细胞形态改变。

2 结果

2.1 壮西对胃癌细胞的生长抑制作用 壮西对胃癌MGC-803细胞的增殖有一定的抑制作用，其生长抑制率随浓度的增加而升高，呈现浓度依赖性趋势。壮西对胃癌细胞生长的最高抑制率达84.87%，高于阳性对照组紫杉醇的抑制率，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 壮西对胃癌细胞的生长抑制

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2 壮西对细胞形态的影响 倒置光显微镜下观察到,正常培养的对照组细胞呈梭形贴壁生长，大小均匀，核圆居中，胞质清亮透明。2.5 mg/mL蒙药处理组作用48 h后，部分细胞失去正常生长形态，细胞变小变圆，胞质亮度下降,胞膜皱缩、内陷；随着时间推移，细胞形状不规则，最后破碎坏死。荧光镜下可见，对照组细胞被Hoechst 33342染色后，发出均匀的蓝色荧光，大小一致,提示为正常活细胞；2.5 mg/mL处理组部分细胞的细胞核或细胞质内出现浓染致密的颗粒状或块状荧光，提示为细胞染色质凝集、核固缩或核碎裂，为凋亡细胞的形态改变。此外，镜下见坏死细胞被PI红染。如图1所示。

3 讨论

细胞异常增殖和分化与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，肿瘤治疗的一个基本问题是如何抑制肿瘤细胞的无限增殖能力。蒙药壮西-21，汉名为寒水石二十一味散，由寒水石、荜拨、诃子、石榴、瞿麦、沙棘、五灵脂、砂仁、紫花地丁、木鳖子、人工牛黄、连翘、木香、降香、麦冬等二十一味药物组成,其药理作用是调体内“赫依”“希拉”“巴达干”三根，具有保护消化道黏膜、抑制胃酸分泌的作用。组方中寒水石、荜拨、五灵脂均具有抗肿瘤的作用[6]，但单体成分或提取物并不能反映蒙药复方的广泛药理作用及蒙医理论，而且蒙药的临床应用主要以复方制剂为主。为从细胞水平揭示蒙药壮西的抗肿瘤作用，本实验以体外培养的胃癌细胞为对象，观察复方蒙药壮西对胃癌细胞生长的影响。

MTT法是目前检测药物在体外对肿瘤细胞杀伤作用常用的方法之一，其原理是利用活细胞特别是增殖细胞内将MTT氧化为蓝紫色甲臜晶体，沉积于细胞内，通过酶标仪检测吸光度，了解细胞的存活情况，而死细胞则不能氧化MTT。本实验通过MTT法观察不同浓度的蒙药壮西组对人胃癌细胞MGC-803生长的影响，结果表明壮西在体外能显著抑制胃癌细胞的生长，尤以高浓度组的抑制率最高，且抑制作用随药物浓度的增加而增强，呈现剂量依赖的趋势。2.5 mg/mL药物处理后对细胞的抑制率超过了紫杉醇组的抑制率。倒置光显微镜下见，蒙药作用后细胞形态发生明显的改变。采用荧光双染法对胃癌细胞的形态学变化进行进一步观察,发现胃癌细胞经壮西作用后，部分细胞核凝集、碎裂成片状，呈凋亡细胞的形态改变，还有部分细胞趋向坏死的改变，表明该药在体外对胃癌细胞发挥生长抑制作用的机制之一，可能是诱导细胞凋亡。组方中的主药寒水石在蒙医中有不同的炮制方法，可用于治疗不同的病症[7]。其中寒水石与与诃子、硼砂、光明盐、荜茇、麦冬组成灰化小剂，赵立远等[8]研究发现该化灰小剂可抑制S-180荷瘤小鼠的肿瘤的生长，其作用机制可能是通过调节免疫，调控凋亡相关蛋白的表达有关。本实验也初步观察到了壮西有诱导细胞凋亡的作用。本实验仅观察了蒙药对胃癌细胞杀伤的生物学效应，其具体的作用机理尚需深入研究。