透明化骨骼染色鉴定海马种类的方法

文/梁亮堂

在外观上鉴定海马的种类主要依靠背鳍和胸鳍的数目进行区分，然而由于海马体色不透明，此法存在一定的误差和不便。针对这一问题，笔者建立并且优化了一套海马透明化骨骼染色观察背鳍和胸鳍数目的方法，能够准确进行数目的鉴定。这种骨骼染色的方法不仅能应用于海马的种类鉴定，还可以应用于新型海马标本的制备，具有科学和观赏价值。

海马是刺鱼目海龙科海马属鱼类的统称，在我国有悠久的药用历史，是常用的名贵中药材，也是水族观赏品种。海马具有明显的马头蛇尾瓦楞身的形态特征，而且与常见的海洋生物不同，性成熟的雄性海马具有育儿袋，而雌性海马没有，属于雄性育儿。目前，全世界海马约有33种，在我国近海，常见的海马品种主要有大海马（Hippocampus k e l l o g g i）、刺海马（Hippocampus histrix）、三斑海马（Hippocampus trimaculatus）、线纹海马（Hippocampus erectus）、管海马（H ippocampus k u d a）、日本海马（Hippocampus mohnikei）等。对不同的海马进行种类鉴定主要依据其体长、体色、吻长、头长、吻长与头长的比例、背鳍和胸鳍的数目、躯干环和尾环的数目、眼棘、鼻棘和脸棘的数目、头冠和棘的特点及有无斑点等特点来区分。这些鉴定方法主要是对海马外观进行形态观察，但是在操作过程中，由于海马体色不透明且背鳍无法伸展开，无法很好地进行观察。笔者利用人工养殖的海马，探索出一套海马透明化骨骼染色的方法，染色后观察背鳍和胸鳍，能够从形态上更加精确地进行种类鉴定。

一、材料与方法

（一）试验材料

海马取自福建省水产研究所小嶝岛实验基地，品种有大海马、刺海马、线纹海马、膨腹海马和日本海马。

（二）试验方法

1.固定：将整只海马在4%PFA溶液固定24小时，期间保持海马浸没在固定液中并在摇床上不断摇动。

2.脱水：除去4%PFA溶液，采用3种方法进行脱水，第一种是直接用不同浓度的丙酮（30%、50%、70%、90%和100%）浸泡脱水，每个梯度丙酮浸泡12小时；第二种是先用不同浓度的乙醇（30%、50%、70%、90%和100%）浸泡脱水，每个梯度乙醇浸泡12小时，之后倒去乙醇，用100%丙酮浸泡脱水24小时。第三种是直接用100%丙酮浸泡96小时脱水。脱水期间保持海马浸没在脱水液中，并在摇床上缓慢不断摇动。操作丙酮时要在通风橱内操作。

3.染色：倒去丙酮溶液，用染色剂染色5天，染色剂配制方法为1体积的0.1%茜素红（溶于95%乙醇）+1体积的0.3%阿利新蓝（溶于70%乙醇）+1体积的100%乙酸+17体积的100%乙醇。

4.脱色：倒去染色液，将海马移入2%的KOH溶液中进行脱色4天。

5.透明：倒去KOH溶液，用不同浓度的甘油（30%、50%、70%、90%和100%）浸泡透明，每个梯度甘油浸泡24小时。

6.拍照：用体视显微镜进行背鳍数目的观察。

二、结果

（一）海马透明化骨骼染色不同脱水方案的比较

在海马的骨骼染色方法中，比较不同的脱水方法的染色结果，如图1所示，第一种浓度梯度丙酮脱水和第二种浓度梯度乙醇和丙酮脱水的方法均能够获得很好的染色效果，而第三种丙酮直接脱水法，在染色效果中呈现局部染色不均匀的结果。可见，第一种和第二种脱水方法满足染色要求。考虑到丙酮属于有毒有机溶剂，第二种脱水方法比第一种更能节省丙酮溶剂的使用量，因此确定第二种浓度梯度乙醇和丙酮脱水方法为更优的脱水方法。

（二）海马背鳍和胸鳍数目的观察

利用优化好的方法对线纹海马进行骨骼染色观察，并且详细记录海马胸鳍和背鳍的数目，结果如图2B、C、D所示，分别为17和18。而不通过骨骼染色，直接对海马进行背鳍计数图片如图2A所示，无法进行有效观察。

图2 线纹海马的骨骼染色观察

表1 不同品种海马背鳍和胸鳍数目观察

（三）不同种海马的骨骼染色观察方法

收集大海马、刺海马、线纹海马和膨腹海马四种海马进行整骨染色，观察背鳍和胸鳍。结果如表1所示。对比文献报道的各种海马背鳍数和胸鳍数，与观察到结果基本一致。

三、小结与讨论

在海马个体透明化骨骼染色过程中，脱水是一个关键的步骤，直接影响后续的染色效果。乙醇和丙酮能够将海马组织中的水分置换出来，使得染料更容易进入到海马组织中。乙醇是常用的组织脱水剂，脱水能力很强，但容易使组织收缩变脆，尤其是100%乙醇更甚。因此在使用乙醇脱水时，需要从低浓度向高浓度进行。跟乙醇相比，丙酮的组织穿透性和脱水性更强，同时丙酮还有脂溶性，能去除组织内的脂肪，但是对组织有剧烈的收缩作用，使用的时候也是必须从低浓度向高浓度进行。此外，丙酮属于有毒的试剂，而且价格比乙醇贵，考虑效果和成本，认为第二种梯度乙醇和丙酮相结合的脱水方法是更优的方法。

海马常见的分类标准之一是背鳍和胸鳍的数目，主要是在体式显微镜下剥离背鳍和胸鳍进行计数，但是这种方法不易操作。将海马进行骨骼染色后再进行观察背鳍和胸鳍数，可以很精确地对海马背鳍和胸鳍进行计数。

海马标本经过骨骼染色后，可以在甘油中长期保存以供实验教学与科学研究使用，同时经过染色的海马标本色彩鲜艳，可以做为特色工艺品销售，可以对养殖过程中意外死亡的海马进行再次利用开发。同时这种染色的方法还可以应用于幼鱼中，观察幼鱼的背鳍和胸鳍以及椎骨数目进行种类鉴定。