抗菌肽及其在水产养殖业的应用（四）

文/王玉堂

上接2019年4期

八、鱼类基因工程抗菌肽的研究

迄今为止，应用于生产中的抗菌肽主要有四种获取方式：一是天然提取法，即直接从动植物个体中提取，但来源有限。二是化学合成法，即通过连接氨基酸残基合成抗菌肽，一般小于10个氨基酸残基的多肽合成较为经济，10个以上氨基酸残基的多肽合成较为昂贵。三是酶解法，即利用水解酶本身不具有活性的蛋白质，使其成为具有活性的肽链。四是基因工程方法，即利用分子生物学手段，通过原核或真核表达系统表达抗菌肽目的基因。采用基因工程方法生产抗菌肽具有成本低、易于工业化大规模生产等特点，是目前国内外研究者的首选。基因工程抗菌肽的研究主要集中在两个方面：一是在分子水平上研究抗菌肽在动物免疫防御系统中的发生和调控机制，为抗菌肽相关产品的研发利用提供理论依据；二是克隆抗菌肽基因，利用微生物系统进行表达，然后利用蛋白质操作技术平台进行收集和提纯。

（一）原核系统表达抗菌肽的研究

大肠杆菌的原核表达系统是迄今为止在基因工程领域应用最多和最完善的系统，这个系统具有成本低、产量高、易于操作等优点；缺点是抗菌肽对原核表达细胞具有很强的杀伤力，所以有时采用融合表达方式。李伟等（2007）从大菱鲆肝脏中鉴定得到hepcidin抗菌肽基因，并构建了谷胱甘肽-S转移酶抗菌肽（GST2-hep）融合表达载体，实现了在大肠杆菌中的融合表达。张虹等从斑点叉尾鮰肝脏中克隆了抗菌肽（LEAP-2），构建了“PET32a-IpL-2”的重组表达质粒，转化至大肠杆菌BL21，得到可溶性融合抗菌肽产物。

虽然融合表达能增加抗菌肽在表达过程中的稳定性，但是，融合标签的存在可能会影响到抗菌肽本身的天然活性。

汪开毓等（2 0 1 8）就斑点叉尾鮰7种常见抗菌肽：Hepcidin，liver-expressedAMP2（LEAP2），bactericidal permeability-in-creasing protein(BPI)，cathepsin D，NK-ly-sin typel，NK-lysin type2，NK-lysin type3进行研究，通过生物信息学软件对7种抗菌肽进行分析，并对其功能片段进行克隆，随后将目的片段融合于PTWINI（含几丁质标签和内含肽）表达载体内含肽的N端，通过摸索诱导条件使内含肽与目的蛋白质之间的肽键断裂，从而获得不含任何标签蛋白质的抗菌肽。目前，该试验已成功构建了几种抗菌肽的重组质粒PTWINIAMP，若能成功地将表达的抗菌肽与融合标签分离开来，将会对抗菌肽的后续研究有重要意义。

采用原核表达系统虽然能够实现抗菌肽的高效表达，但也存在诸多问题。首先就是抗菌肽的宿主细胞毒性。宿主细胞表达的抗菌肽：一是会反馈性地抑制宿主细胞增殖，从而影响抗菌肽的进一步表达。二是容易被降解，由于抗菌肽在表达过程中对蛋白质酶非常敏感，抗菌肽本身带有大量正电荷，在宿主细胞中容易被降解，难以实现大量表达。三是大肠杆菌缺乏翻译后修饰加工机制，表达的蛋白质不能进行正确的折叠，常以包涵体形式上存在，影响生物活性，需要进行变性、复性等复杂操作才能得到活性蛋白质，有时不适合表达结构复杂的蛋白质。因此，在原核表达方面，如何保持其结构与活性的同时，降低其细胞毒性是急需解决的问题。

（二）真核系统表达抗菌肽的研究

酵母作为工程菌表达外源蛋白质技术是近年来日益增长发展起来的真核表达体系。酵母作为低等真核生物具有细胞生长快、营养要求低、易于规模化生产、遗传操作简单等特点，能够对表达的蛋白质进行正确加工、修饰及合理的空间折叠，不会产生内毒素，有雌酵母的表达产物分泌于胞外，既可以减轻宿主细胞代谢负荷，又可减少宿主细胞蛋白质酶对外源蛋白质的降解，提高蛋白质表达活性，可获得较高的表达量，利于表达产物的分离纯化，非常有利于对真核生物基因的表达。

虽然酵母表达系统是抗菌肽基因应用最为理想的表达系统之一，但也受到宿主菌状态、转化基因表达效率、内源蛋白质酶活性等诸多因素的影响，其表达结果不理想的报道也常见。因此，抗菌肽是否适合酵母中表达，需要根据其活性特点具体分析，针对不同类型采取不同策略来构建表达载体，从而实现抗菌肽的高效高质表达。

随着鱼类相关文库和蛋白质表达谱的建立以及基因工程技术的发展，表达和利用抗菌肽基因将会更加方便。天然抗菌肽基因经过有目的地人工设计和改造，可以生产稳定性更高、活性更强的抗菌肽，对抗菌肽基因筛选、改造设计以及表达载体筛选方面的深入研究，可提高基因表达的高效性和稳定性，基因工程抗菌肽替代天然抗菌肽在理论和实践上是完全可行的。

九、抗菌肽在水产养殖业中存在的问题及未来研究重点

（一）存在问题

虽然人们对抗菌肽的分离、结构和功能研究逐渐深入，但实现商业化生产和应用的产品较少。因为在应用领域还存在许多问题。

1.商业化生产难度大

因为抗菌肽主要是由生物机体自身产生，含量低，从生物体中分离和提纯难度大。研究表明，可通过营养调控来控制内源抗菌肽的表达，利用维生素D3是最主要的手段。此外，还有研究发现，丁酸、锌、多糖和精氨酸等也可以对抗菌肽的表达发挥调控作用。但是，这种营养调控手段还研究得不够深入和全面，能达到治疗效果的产品有限。人工合成方法虽然能解决抗菌肽量化生产问题，但生产成本高，产量低，活性或功效低等。

利用基因工程技术进行抗菌肽基因表达以降低生产成本和提高产量，可以达到量化生产的目标，这也是目前人们研究的重点。在杆状病毒表达系统、原核表达系统和真核表达系统中，根据不同种类抗菌肽的特点，选择和优化抗菌肽表达系统至关重要。但是，抗菌肽具体结构与其功能密切相关，体外合成的抗菌肽与天然抗菌肽虽然一级结构一致，但空间结构存在一定差异，往往活性较差，因此，基因工程合成抗菌肽与天然抗菌肽的功能差异还有待于进一步研究。

2.天然抗菌肽的生物活性低

天然抗菌肽的生物活性低、效果不理想，稳定性差，容易被蛋白酶水解。如何提高天然抗菌肽活性是一大难题。有科研人员采用生物化学方法对抗菌肽的分子结构等进行改造，利用构效原则来提高其生物活性和稳定性。现阶段主要有以下四种方法：嵌全形成杂全肽；利用生物化学手段改造天然抗菌肽；载取天然抗菌肽活性片段；通过肽文库与计算机模拟进行高能量筛选。

目前，抗菌肽在水产养殖动物上的应用产品和产量还较少，大量的研究主要集中在其作为饲料添加剂来增强养殖动物的免预防作用，虽然这些研究取得一些进展，但大都是采用其它物种的抗菌肽作为水产养殖动物的饲料添加剂，虽有一定效果，但具有“种属”专一性或特异性的抗菌肽对水产养殖动物的强效和更多的小副作用等问题还有待于进一步研究。

鱼类的抗菌肽种类很多，哪些种类具有更好的疗效和更好的经济性需要进一步探索。抗菌肽的副作用问题也有待于进一步研究。姜珊等发现抗菌肽添加过量会导致罗非鱼的增重率下降，这可能是因为高浓度的抗菌肽会抑制罗非鱼肠道中有益菌群的生长，从而影响动物的消化吸收功能。由于抗菌肽抗菌谱广、杀伤力强，对宿主细胞甚至也有一定的毒性，如何在保持其结构与活性的同时降低其细胞杀伤力需要到时候深入的研究。

3.抗菌肽并不是抗生素

有些人对抗菌肽了解和认识不深，担心抗菌肽会产生抗菌素样作用以及细菌耐药性等问题。其实，抗菌肽与抗生素是有本质区别的。

（1）来源不同。抗生素是由微生物（细菌、真菌、放线菌等）在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，如青霉素来源于青霉菌产生的次级代谢产物。而抗菌肽是指生物体内经诱导而产生的多肽物质。

（2）生产方式不同。抗生素是一系列酶促反应产物。而抗菌肽是通过基因编码合成，由DNA到RNA到蛋白质（多肽），合成迅速。

（3）对机体的免疫作用不同。许多抗生素不能提高机体免疫力，甚至还对免疫有抑制或损伤作用。而抗菌肽为宿主防制性肽，在宿主先天免疫系统中有重要的调节作用，能提高机体的非特异性免疫能力。

（4）抗病原生物活性不同。抗生素主要是抗菌作用，而抗菌肽具有多种生物活性，除对细菌的抑制或杀灭作用外，对真菌、病毒、原生虫都有一定的抑制或杀灭作用。

（5）抗菌机制不同。抗生素大多是通过抑制细菌细胞壁或DNA的合成而发挥作用，通常有特定的作用位点，与细菌细胞膜上或胞内特异的靶位结合，且靶位类型有限，细菌容易通过变异产生耐药性。而抗菌肽主要作用于细菌的细胞膜上，通过与细细胞膜相互作用改变脂双层膜构造，造成膜的物理性损伤，破坏细胞膜的完整性，使细胞膜的通透性增加，细胞内外渗透压失衡，细胞内容物外泄，致使细菌死亡而起到杀菌作用。抗菌肽的作用不涉及特定靶位，完全是阴阳离子的物理作用，由于细菌表面的结构和带电性能无法改变，因此而很难产生抗药性。

（二）未来研究重点

由于抗菌肽替代抗生素的研究是近几年才发展起来的，虽然取得了一定进展，但还处于探索阶段，距离技术成熟、大规模生产和应用到动物养殖中还有很多需要解决的问题。一是抗菌肽的种类很多，哪些种类作为饲料添加剂时效果好，又比较经济。二是不同种类的抗菌肽之间的相互作用情况。三是抗菌肽在动物体内的含量较少，天然资源匮乏，化学合成的成本太高，目前还无法实现规模化生产；需要从基因工程技术方法方面研究如何大规模生产抗菌肽，或通过日粮因素调控抗菌肽基因的表达。四是抗菌肽在动物体内容易被蛋白酶水解，需用脂质包被或对其进行化学修饰保护，这需要对其释放机制、受体结合、降解活性及其类似物的结构与活性等进行研究。五是目前对抗菌肽作为饲料添加剂真正在实际生产方面的试验还较少，其效果及是否有副作用还需进一步研究证实。