HPLC原子荧光法同时测定辣椒红中3种辣椒碱类物质含量

王继伟，杨松梅，李佳华，陈艳晶

（云南瑞宝生物科技股份有限公司，云南 昆明 651701）

辣椒红色素产品中含有的辣椒碱类物质包含辣椒碱（capsaicin）、二氢辣椒碱 (dihydrocapsaicin)和降二氢辣椒碱 (nordihydrocapsaicin)等香草酰胺类生物碱混合物[1]。目前，辣椒碱类化合物的测定方法主要有可见分光光度法、FAO紫外双比色法、高效液相色谱法、气-质联用测定法[6-8]、HPLC-MS/MS法[5]。其中辣椒碱 (capsaicin,C)和二氢辣椒碱 (dihydrocapsaicin,DC)约占总量的90%以上，降二氢辣椒碱 (nordihydrocapsaicin,NDC)7%，高辣椒碱 (homodihydrocapsaicin,HC)1%[2]，这几种生物碱活性物质具有很高的药用价值，同时被广泛用于食品添加剂和饲料等领域[3]。

辣椒素含量的高低是评价辣椒品质的重要指标之一[4]。因此，检测辣椒红中辣椒素含量具有重要意义。上述这些方法存在前处理较为繁琐、检测误差相对较大等问题。基于此，本文通过对样品前处理方法和色谱条件进行优化，旨在建立较为简便、快捷、可靠的辣椒素含量检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters2695高效液相色谱仪（配荧光检测器）；HJ-4多头磁力搅拌器（金坛市医疗仪器厂）；Molatom1860d纯水机（上海摩勒科学仪器有限公司）；分析天平（METTLER TOLEDO）。

辣椒碱，二氢辣椒碱，降二氢辣椒碱标准物质，纯度≥98%；甲醇，乙腈，乙酸，均为色谱纯；一级水。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

称取一定量的辣椒碱，二氢辣椒碱，降二氢辣椒碱标准物质分别置于10 mL的容量瓶中，甲醇稀释定容，配制成浓度分别为550mg/L，593mg/L，522mg/L的标准储备液，冷藏保存。

准确移取一定量的各标准储备液于10mL的容量瓶中，甲醇稀释定容，配制成浓度均为100 mg/L的混合标准溶液，冷藏保存。

工作标准溶液根据实际使用浓度进行稀释，现配现用。

1.2.2 样品前处理

称取2g辣椒红样品（精确到0.0001g） 置于锥形瓶中，加入100mL甲醇，用磁力搅拌器搅拌提取15min后，将上清液过滤，收集滤液于100mL的容量瓶中，用甲醇定容，经0.22μm滤膜过滤，进样分析。

1.2.3 色谱条件

采用 Sino chrom ODS-BP（4.6mm×250mm，550） 分离；进样量20离；，柱温30℃；荧光检测器激发波长275nm，吸收波长310nm；乙腈-1%乙酸进行洗脱，洗脱条件见表1。

表1 洗脱条件Teb.1 Elution requirement

2 试验方法

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 洗脱条件优化

考察了乙腈-1%乙酸的洗脱情况，当采用乙腈-1%乙酸（40%～60%）等度洗脱时，组分峰型良好，但分析时间较长；将等度洗脱改为梯度洗脱时，出峰时间提前，样品的分析时间缩短为20min，故实验最终采用梯度洗脱作为分析条件。

2.1.2 波长优化

对降二氢辣椒碱，辣椒碱，二氢辣椒碱的激发波长和吸收波长进行了比较，最终确定激发波长为275nm，吸收波长310nm。

本文采用 Sino chrom ODS-BP（4.6mm×250mm，550）作为分析柱，并对进样量，柱温，流速等参数做了考察，最终确定了1.2.3色谱条件，3种组分的色谱图见图1。

2.2 样品前处理方法优化

2.2.1 提取溶剂的选择

实验在参考辣椒碱国标测定法的基础上，考察了甲醇水溶液（30%，50%，70%，90%）和甲醇对辣椒碱的提取效果。实验得出，甲醇的比例越大，对3个组分的提取效果越好。最终选择甲醇作为提取剂。

图1 3种组分标准色谱图The three Components standard chromatogram

2.2.2 料液比的选择

比较了 100mL甲醇对 1.2，1.4，1.6，1.8，2.0，2.2，2.4g样品的提取率。实验得出，提取率随着称样量增加而增加，当称样量增到1.8g后，提取率相当。故实验最终选择1.8g作为最佳称样量。

2.2.3 提取时间的选择

实验比较了 10min，15min，20min，25min，30min下，辣椒碱等组分的提取情况。发现，样品搅拌15min后，提取率没有显著增加，因此，选择提取时间为15min。

2.3 标准曲线及方法检出限

将混合标准溶液逐级稀释，配制得系列工作标准溶液，置于自动进样瓶中，上液相色谱进行分析，并记录保留时间及其峰面积，根据浓度对峰面积绘制得曲线，见表2。

2.4 回收率及精密度

准确称取样品，加入3个水平的标准物质，按1.2.3条件测定。通过实际测定值计算样品加标回收率，结果见表3。

表2 3种组分的线性方程及检出限Teb.2 Linear equation and detection limit of components

表3 样品加标回收率及精密度Teb.3 Standard recovery and precision of sample

2.5 重复性试验

分别称取同一批号辣椒红产品样品6份，按照1.2.2样品前处理方法，平行制备6份供试品溶液，按照1.2.3色谱条件，各进样量20条件，分别测定辣椒碱峰面积为：477016、476852、478421、486098、476851、489154；、二氢辣椒碱 峰 面 积 为 ： 403877、 395874、 405861、405985、400859、406892；降二氢辣椒碱的峰面积 为 ：45802、44965、 46058、45608、46358、46548，其对应的RSD分别为1.14%、1.04%、1.24%，结果表明该含量测定方法具有较好的重复性。

2.6 供试品溶液的稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样20h分，按照1.2.3色谱条件分别测定峰面积为：380292、389561、372584、381541、388015、383909；二氢辣椒碱峰面积为 ： 371164、 380587、 364587、 373589、376524、376858；降二氢辣椒碱峰面积为：52688、53791、51858、52515、52944、53131，其对应的RSD分别为1.59%、1.49%、1.22%，表明供试品溶液在室温下24h内稳定性良好，满足测定要求。

2.7 样品测定及方法推广

实验测定了6个辣椒红样品，含量见表4。将该方法应用到饲料辣椒产品中辣椒碱等组分含量测定，结果表明，该方法精密度好，测定结果满足分析要求，详见表4。

表4 辣椒红样品测定结果Teb.4 Determination of paprika oleoresin samples

3 结果与讨论

本文以色谱柱Sino chrom ODS-BP（4.6mm×250mm，550） 作为分析柱，采用高效液相色谱荧光检测法分析测定了辣椒红中辣椒碱，二氢辣椒碱，降二氢辣椒碱的含量。辣椒红产品中组分加标回收率为76.7%～99.5%，精密度为0.2%～10.7%。结果表明，该方法具有较好的重复性及良好的稳定性，步骤简单、易操作、检测时间短、结果准确度高，能有效降低分析成本，明显提高工作效率，为以后分析检测辣椒红产品中辣椒素含量提供简便、高效、准确的分析方法。