高效液相色谱法检测脱毛类化妆品中巯基乙酸含量的不确定度分析

郝霞莉 李根池 曹 威

脱毛膏是较常见的一种脱毛类化妆品，主要成分是巯基乙酸(钙)，其巯基可以与毛发中的蛋白结构相结合，使毛发溶解，以达到脱毛的目的，尤其适合怕痛而肌肤不易过敏的人群，因此倍受青睐[1]。巯基乙酸易经皮吸收，对人体产生较强的毒性。脱毛类化妆品作为人们常用且用量大的化妆品，其巯基乙酸含量是否在安全范围直接关系到使用者的健康，因此对脱毛类化妆品中的巯基乙酸含量进行准确的测定显得尤为重要[2-6]。通常，检验检测机构采用国家标准化妆品卫生规范(2015版)中的高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法测定化妆品中巯基乙酸的含量，该方法相对简单方便[7]。

为了评估HPLC方法中对检测结果影响较大的不确定度因素，依据国家计量技术规范《测量不确定度评定与表示》(JJF 1059.1-2012)[8]的要求，对该方法测定结果的不确定度进行分析，为评定检测结果的可靠程度提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

巯基乙酸标准品(95.0%，加拿大Toronto Research Chemicals公司)；乙腈[色谱纯，ThermoFisher科技(中国)有限责任公司]；C8色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大连伊利特公司)。

1.2 仪器与设备

Waters-2695型高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器紫外检测器(美国Waters公司)；XP205DR分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；IKA MS3漩涡振荡器[莱贝(上海)科学仪器有限公司]；MJ-300型超声波清洗机(无锡市美极超声设备有限公司)。

1.3 实验方法

(1)标准溶液的配制。准确称取30 mg(精确到0.1 mg)巯基乙酸标准品于25 ml容量瓶中。用流动相溶解并定容至刻度，配制成浓度为1200 μg/ml的标准储备液。用流动相将巯基乙酸标准储备液逐级稀释成浓度分别为24 μg/ml、60 μg/ml、96 μg/ml、120 μg/ml以及180 μg/ml的标准工作液。

(2)试样制备。精密称取0.25 g样品于25 ml具塞离心管中，加少许乙腈+水(10+90)涡旋60 s使样品分散，继续加乙腈+水(10+90)定容至接近刻度，超声15 min，取出，定容至25 ml刻度，摇匀，取上层溶液，用0.45 μm有机系滤膜过滤。根据需要进行稀释待测[9]。

(3)色谱条件。①色谱柱，伊利特C8 5μm，4.6 mm×250 mm；②流动相，乙腈+0.01 mol/L KH2PO4(磷酸调至pH值为2.5)=(10＋90)；③流速，1 ml/min；进样量：10 μl；④柱温，30 ℃；⑤检测波长，215 nm；⑥检测器，二极管阵列检测器-2998。

(4)数学模型的建立。巯基乙酸的计算为：

式中X为试样中巯基乙酸含量，μg/kg；C为从标准曲线得到巯基乙酸的质量浓度，μg/ml；V为样品定容体积(ml)；m为样品取样量(g)。

(5)由于《化妆品安全技术规范》(2015版)中第四章3.9巯基乙酸是使用标准曲线法对试样中巯基乙酸进行定性和定量检测，所以试样测定结果的不确定度除C、V、m外，标准曲线、试样测量重复性、仪器进样重复性和回收率都对测定结果产生影响。则由上式可转化为：

式中R为回收率，f重为重复性修正因子，f校为校正曲线拟合修正因子。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

从测量过程和数学模型分析，试样测定的相对标准不确定度主要由标准溶液配制urel(C)、试样称量urel(m)、试样定容urel(V)、标准曲线拟合urel(C0)、试样测量重复性urel(R)以及仪器进样重复性urel(Q)几个方面引入[10]。

2.2 各分量相对标准不确定度评定

2.2.1 标准溶液配制引入的相对标准不确定度urel(C)标准溶液由巯基乙酸标准品经过称量、定容及稀释配制而成，所以标准溶液配制过程引入的相对标准不确定度由标准品纯度、天平称量、标准储备液定容和标准工作液稀释而组成。

(1)标准品纯度引入的不确定度urel(C1)。由巯基乙酸标准品证书可知，纯度为95.0%，按均匀分布处理[11]。则其标准不确定度为：=0.02887，其相对标准不确定度为：

(2)天平称量引入的不确定度urel(C2)。称取巯基乙酸标准品使用的电子天平的检定证书给出在d=0.01 mg、0≤m≤5 g条件下，其最大允许误差为±0.05 mg，按矩形分布考虑[10]其引入的标准不确定度为：=0.02887mg， 精确称量30 mg巯基乙酸标准品，其相对标准不确定度为：

(3)标准储备液定容引入的不确定度urel(C3)。使用25 ml容量瓶定容巯基乙酸标准储备液，依据JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》[12]。20 ℃时25 ml容量瓶(A级)的容量允差为±0.030 ml，按三角分布考虑，其标准不确定度为：=0.01225ml ，其相对标准不确定度为：

巯基乙酸标准储备液由10%乙腈配制而成，20 ℃时玻璃的体积膨胀系数为(2.5×10-5)℃[13]。乙腈的体积膨胀系数为(1.4×10-3)℃，水的体积膨胀系数为(2.1×10-4)℃，则10%乙腈水的平均体积膨胀系数为(1.64×10-4)℃[14-15]。假设25 ml容量瓶的使用温度与室温一致，实验时室温为23.9 ℃，则由校准温度与使用温度不同引起的体积不确定值为：

ΔV=V1-V2=(α平均-α玻璃)×V×ΔT=0.01355ml

按三角分布考虑，使用25 ml容量瓶时，其标准不确定度为：=0.005532ml，其相对标准不确定度为：

则合成标准储备液定容的相对标准不确定度为：

(4)标准工作液稀释urel(C4)。标准工作液由标准储备液分别稀释配制而成，使用了规格分别为5～50μl、20～200μl、100～1000μl、100～5000μl的移液器和10 ml容量瓶。依据移液器校准证书，当k=2时，这3种规格移液器的扩展不确定度依次为u(200 μl)=0.4 μl、u(1000 μl)=0.5 μl和u(5000 μl)=0.6 μl，则其标准不确定度分别为：

其各自相对标准不确定度见表1。

表1 标准系列配制过程中移液器校准引起的不确定度

使用10 ml容量瓶配制标准工作液，依据JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》[12]。20 ℃时10 ml容量瓶(A级)的容量允差为±0.020 ml，按三角分布考虑，其标准不确定度为：

其相对标准不确定度为：

巯基乙酸标准工作液由10%乙腈水配制而成，20 ℃时玻璃的体积膨胀系数为2.5×10-5/℃[13]；水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃[15]；乙腈的体积膨胀系数为1.4×10-3/℃，则10%乙腈水的平均体积膨胀系数为1.64×10-4/℃[14]。假设10 ml容量瓶的使用温度与室温一致，实验时室温为23.9 ℃，则由校准温度与使用温度不同引起的体积不确定值为：

按三角分布考虑，使用10 ml容量瓶时，其标准不确定度为：

其相对标准不确定度为：

则合成标准工作液稀释过程的相对标准不确定度为：

则合成标准溶液配制的相对标准不确定度为：

2.2.2 试样称量引入的相对标准不确定度urel(m)

待测试样同样使用十万分之一天平进行称量，根据电子天平检定证书，在d=0.1 mg、0≤m≤50 g条件下，其最大允许误差为±0.5 mg，按矩形分布考虑，其标准不确定度为：

称取试样0.2515 g，其相对标准不确定度为：

2.2.3 试样定容引入的相对标准不确定度urel(V)

使用100～5000 μl移液器移取1500 μl流动相定容试样，依据移液器校准证书，当k=2时，U=0.6 μl，则其标准不确定度为：

则其相对标准不确定度为：

2.2.4 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(C0)

测定过程中采用1200 μg/ml的巯基乙酸标准储备液配制成浓度分别为24 μg/ml、60 μg/ml、96 μg/ml、120 μg/ml和180 μg/ml的标准工作液，将这5个浓度的标准工作液分别上机检测6次，测得的峰面积结果见表2。采用最小二乘法拟合，得到标准曲线的线性回归方程为：Y=bX+a=4298.3X＋21958.2，相关系数r=0.9998，其中

峰面积测量的标准偏差为：

应用该曲线进行测量时，对被测试样检测10次，即p=10，测得试样中巯基乙酸的浓度见表3。

由表3计算，试样中巯基乙酸的平均浓度为32.085 μg/ml，试样质量以0.2515 g计，得到的试样中巯基乙酸的最佳估计值为3.189 μg/kg。

校准曲线拟合的标准不确定度为：

式中S为峰面积测量的标准偏差，数值为1506.33；b为校准曲线的斜率数值为4298.3；p为试样测定次数，数值为10；n为校准溶液的测定次数，数值为30；Sxx为标准溶液浓度残差的平方和，数值为84672；C0为试样中巯基乙酸的平均浓度，数值为32.085 μg/ml；C 为巯基乙酸标准溶液的平均浓度，数值为96 μg/ml。

标准曲线拟合的相对标准不确定度为：

2.2.5 试样测量重复性引入的相对标准不确定度urel(R)

对3.0 μg/kg浓度添加的试样进行10次平行测定，所得结果见表4。

为确定回收率校准因子f重是否在计算公式中采用，对平均回收率进行了显著性检验[10-11，13]。显著性检验采用t检验，当检验值t大于或等于临界值t(95，10)=2.23[10-11，13]时，则平均回收率与100%有显著性差异，表明校准因子必须在计算公式中采用，用于修正结果，否则不采用。

本实验t值为0.126，小于临界值2.23，表明平均回收率与100%无差异显著，在计算公式中可忽略校准因子。试样测量重复性引入的相对标准不确定度为：

2.2.6 仪器引入的相对标准不确定度urel(Q)

对浓度为120 μg/L标准溶液进行6次重复测定，所得峰面积见表5。

表2 标准曲线拟合数据

表3 试样液中巯基乙酸浓度结果

表4 试样重复性测量结果

表5 重复进样测量结果

单个峰面积的标准偏差为：

试样测定平均值的A类标准不确定度为：

其相对标准不确定度为：

2.3 合成标准不确定度评定

根据各分量相对标准不确定度的评定，归纳出不确定度的分量、来源及相对标准不确定度见表6[12-13]。

由表6，合成相对标准不确定度为：

表6 相对标准不确定度总结

试样中巯基乙酸含量的合成标准不确定度为：

u(X)=X·urel=3.189μg/kg×0.03180=0.1014μg/kg

通过对脱毛类化妆品中巯基乙酸含量的不确定度各分量的评定，由表6的数据可以看出：标准溶液配制、试样测量重复性以及仪器进样重复对结果的影响较大；其次是标准曲线拟合和试样称量；试样定容引入的不确定度极小，可以忽略不计。

2.4 扩展不确定度评定

扩展不确定度由合成标准不确定度乘以包含因子得到，取置信水平95%，则k=2，脱毛类化妆品中巯基乙酸含量的扩展不确定度为：

用高效液相色谱法测定脱毛类化妆品中巯基乙酸含量，当取样量为0.25g，k=2(置信水平95%)时，测得脱毛类化妆品中巯基乙酸含量为(3.189±0.2028)μg/kg。

3 结论

通过使用高效液相色谱法对脱毛类化妆品中巯基乙酸含量的不确定度各分量的测定，从最终数据分析，影响检测结果的三大因素由大到小依次为标准溶液配制(B类评定)、试样测量重复性(A类评定)及标准曲线拟合(A类评定)；其次是仪器进样重复(A类评定)和试样称量(B类评定)；试样定容(B类评定)引入的不确定度极小，可以忽略不计。从评定类型分析，六大分量中B类评定所占不确定度比A类评定小，B类评定不确定度主要来源于校准证书、厂家说明书、第三方权威机构发布的量值等客观因素，A类评定不确定度主要来源于多次测量所得量值等主观操作[16]。

为提高检测数据的准确性，在实际的检验检测过程中可通过提高标准品纯度、调整实验环境温度以及使用精确的移液量器来减小标准曲线配制过程中产生的误差；可通过依据样品实际浓度合理设置标准曲线、增加标准曲线各浓度点的测定次数来减小标准曲线拟合产生的不确定度；试样前处理操作过程中产生的误差可通过制定规范的实验操作规程以及使用检定合格的计量器具，尽量减小干扰，从而保证检验结果的准确性[10]。