联合多个修复相关基因的mRNA用于大鼠骨骼肌损伤时间推断

（山西医科大学法医学院，山西 太原 030001）

损伤时间推断一直是法医病理学研究和鉴定的重点和难点。骨骼肌损伤后，静止的肌卫星细胞被激活、增殖、分化，相互融合为成肌细胞，最终形成多核的肌纤维。骨骼肌损伤修复是一个与时间变化密切相关的过程[1]，由此可以推测，骨骼肌损伤后肌卫星细胞增殖、分化至成肌细胞和肌纤维，相关的指标应表现出与时间相关的变化，可作为损伤时间推断的指标。

DNA聚合酶δ相互作用蛋白3（polymerase deltainteracting protein 3，POLDIP3）、类染色体浓缩调节样蛋白（regulator of chromosome condensation 1 like，RCC1L）、高脯氨酸蛋白5（proline-rich 5，PRR5）、核糖核酸输出蛋白1（ribonucleic acid export 1，RAE1）参与肌纤维形成中能量供给、肌卫星细胞增殖和分化过程[2-9]。本研究通过用重力锤以自由落体的方式砸伤大鼠右后肢的方法，建立早、中期不同损伤时间大鼠肌肉挫伤动物模型，观察大鼠骨骼肌挫伤后修复过程中的组织形态学变化，采用逆转录实时定量聚合酶链反应（reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）方法，以核糖体蛋白 L13（ribosomal protein L13，RPL13）、RPL32的mRNA作为双内参，使用探针法检测损伤后肌肉组织中Rae1、Prr5、Rcc1l、Poldip3mRNA的相对表达量变化，研究其联合应用于推断损伤时间的方法。

1 材料与方法

1.1 骨骼肌损伤模型制备和检材提取

SD大鼠78只，雌雄不限，10～12周龄，体质量250～300 g，由山西医科大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为对照组和损伤后 4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h组，每组6只。3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射（40 mg/kg）进行麻醉。用500 g重力锤通过塑料套管从高30 cm处以自由落体的方式打击大鼠右后肢股四头肌，制作大鼠骨骼肌损伤模型[10]，造模成功后的大鼠重新放入笼中正常饲养。

于损伤后4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44和48 h采用腹腔注射致死量[11]戊巴比妥钠溶液处死大鼠，待呼吸、心搏完全停止后，在损伤中心区取1.0cm×1.0cm×0.5cm大小的骨骼肌组织用4%多聚甲醛溶液固定24 h，用于苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。另在损伤中心区取100 mg肌肉组织，迅速置于液氮中速冻后，放入-80℃低温冰箱中保存。

对照组大鼠同法处死后直接在损伤组相应部位取材。

本动物实验方法已获山西医科大学科学研究伦理审查委员会批准。

1.2 总RNA提取与RT-qPCR

采用TRIzol总RNA提取试剂盒（日本TaKaRa公司）提取大鼠肌肉组织中总RNA，利用Infinite®200 PRO NanoQuant检测仪（瑞士Tecan公司）测定总RNA纯度及浓度，当D260/D280在1.8～2.0时可用于后续实验。使用AlleleID 6.0软件设计内参基因RPL13、RPL32及目的基因的引物和探针[12]，详细信息见表1。取400 ng总RNA利用PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒（日本TaKaRa公司）反转录为cDNA。按Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）试剂盒（日本TaKaRa公司）说明书配制反应混合液，利用CFX384 TouchTM荧光定量PCR检测系统（美国Bio-Rad公司）进行RT-qPCR。反应条件为：95℃ 30 s，95℃ 5 s，62℃ 40 s，40个循环。扩增效率在90%～110%范围内、相关系数在0.980以上，认为体系稳定、扩增良好，可用于后续实验。

表1 内参基因RPL13、RPL32及目的基因Rae1、Rcc1l、Poldip3、Prr5的引物及探针序列

续表1

1.3 骨骼肌石蜡切片制作与HE染色

对损伤中心区骨骼肌进行适当修整，使肌束横断面平整，用4%多聚甲醛溶液固定后，经脱水、浸蜡、包埋后，使用RM2135石蜡切片机（德国Leica公司）制作成4μm厚切片，利用HE染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）进行染色，于BX61型显微镜（日本Olympus公司）下观察。

1.4 统计学处理

使用SPSS 24.0软件对通过RT-qPCR测得的4种基因的相对表达量进行单因素方差分析，检验水准α=0.05。目前高通量mRNA芯片和第二代高通量测序均以高于对照组相对表达量的两倍作为筛选差异表达基因的依据[12]。本研究亦采用该标准，认为表达量升高倍数＞2时与表达量升高倍数≤2时的表达性质不同（即是否为高表达）。根据4种基因主要的高表达时间范围区分时间段（时间段内的时间点中高表达的指标数≥2个）。结合组织形态学观察与时间点的表达模式对损伤组进行初步分组。采用Fisher判别分析方法[13]验证分组的准确性，模型稳定时计算判别的准确率[14-15]。最后通过留一法对建立的关于损伤时间推断的Fisher判别模型进行交叉验证[16]。

2 结 果

2.1 大鼠骨骼肌损伤后的组织病理学改变

大鼠骨骼肌损伤后不同时间点的组织病理学改变见图1。对照组大鼠骨骼肌呈多边形，横纹清楚，细胞核较小且位于肌细胞周围及膜下，肌纤维排列整齐，未见坏死、水肿；损伤后4h可见损伤区肌细胞水肿、坏死明显，细胞核消失，但未见炎症细胞浸润；损伤后8～12h可见损伤区有红细胞与少量炎症细胞存在；损伤后16～24h可见损伤区大部分肌细胞溶解、消失，炎症细胞大量浸润并伴有纤维组织出现；损伤后44～48 h损伤区成纤维数量明显增加，并伴有少量毛细血管生成。

2.2 总RNA质量检测与RT-qPCR结果

提取的总RNA经Infinite®200 PRO NanoQuant检测后，证实D260/D280值均在1.8～2.0，RNA纯度较理想，可用于后续实验。

将cDNA进行梯度稀释后测量各目的基因（Rae1、Prr5、Rcc1l、Poldip3）及内参基因（RPL13、RPL32）的扩增效率：Rae1的扩增效率为103.7%，相关系数为0.993；Prr5的扩增效率为97.1%，相关系数为0.993；Rcc1l的扩增效率为100.2%，相关系数为0.996；Poldip3的扩增效率为103.7%，相关系数为0.993；RPL13的扩增效率为105.5%，相关系数为0.997；RPL32的扩增效率为103.3%，相关系数为0.997。这说明体系稳定，扩增良好，可用于后续实验。

2.3 大鼠骨骼肌损伤后Rae1、Prr5、Rcc1l和Poldip3 mRNA的表达情况

Rae1、Prr5、Rcc1l、Poldip3mRNA在骨骼肌损伤后的表达量均有变化，详见表2。Rae1mRNA在损伤后16、20和24 h的表达量与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），其表达倍数均小于2；Prr5mRNA在损伤后16、20、24、28、32和48h的表达量与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），但其表达倍数只在损伤后16、20、24和28 h大于2；Rcc1lmRNA在损伤后4、8、12、16、24、28、36、40和44 h的表达量与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），但仅在损伤后 4、8、16、24、28和 36 h的表达倍数大于 2；Poldip3mRNA在损伤后4、8、16、20、24和28h的表达量与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），在损伤后8、16、20、24和28h的表达倍数大于2。

从表2可知，4种基因在损伤后16～28h主要呈高表达趋势，因此，将损伤后的12个时间点细分为4～12h、16～28h、32～48h 3个时间段。

2.4 大鼠骨骼肌损伤后Rae1、Prr5、Rcc1l和Poldip3 mRNA的Fisher判别结果

结合组织病理学染色结果和4种基因的表达模式进行初步分组后，进一步建立Fisher判别模型进行分析。Fisher判别结果显示，每个样本被正确分组的准确率达85.9%，原始分组时对照组与损伤组判别的准确率分别为83.3%和86.1%（表3）。对模型进行留一法交叉验证后对照组与损伤组判别的准确率分别为83.3%和84.7%（表4）。

图1 大鼠骨骼肌损伤后不同时间点的组织病理学改变（HE×400）

表2 大鼠骨骼肌损伤后不同时间点4种基因的相对表达量 （n=6，±s）

表2 大鼠骨骼肌损伤后不同时间点4种基因的相对表达量 （n=6，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05

Poldip3 mRNA 1.00±0.00 1.88±0.241）2.15±0.271）0.90±0.17 2.03±0.091）2.03±0.151）2.10±0.131）2.01±0.061）1.44±0.24 0.95±0.11 1.23±0.18 1.41±0.06 1.16±0.31组别对照伤后4h伤后8h伤后12h伤后16h伤后20h伤后24h伤后28h伤后32h伤后36h伤后40h伤后44h伤后48h Rae1 mRNA 1.00±0.00 0.91±0.31 1.17±0.25 0.81±0.11 1.65±0.211）1.54±0.201）1.61±0.231）1.05±0.19 0.72±0.31 0.92±0.21 1.06±0.23 1.11±0.09 1.08±0.11 Prr5 mRNA 1.00±0.00 1.06±0.13 1.18±0.15 0.97±0.10 2.37±0.221）2.12±0.061）2.11±0.201）2.01±0.161）1.71±0.331）1.36±0.27 1.68±0.18 1.71±0.24 1.78±0.271）Rcc1l mRNA 1.00±0.00 3.08±0.051）2.37±0.221）1.86±0.131）2.18±0.151）1.57±0.09 2.11±0.131）2.04±0.191）1.42±0.21 2.15±0.171）1.85±0.111）1.95±0.201）1.41±0.10

表3 对照组与损伤组的分类结果［n（%）］

表4 对照组与损伤组留一法交叉验证后的分类结果［n（%）］

每个样本被正确分类的准确率达77.8%，原始分组时各时间段判别的准确率分别为83.3%、79.2%、73.3%（表5），留一法交叉验证后3个细分的时间段判别的准确率分别为83.3%、75.0%、73.3%（表6）。选取不加权法计算各时间段质心后得到时间段间Fisher判别的散点图，直观地反映这3个细分的时间段之间有明显的区分（图2）。

表5 损伤后4～12h、16～28h、32～48h间的分类结果［n（%）］

表6 损伤后4～12h、16～28h、32～48h间交叉验证后的分类结果 ［n（%）］

图2 损伤后不同时间段的Fisher判别散点图

3 讨 论

损伤时间推断在确定死亡时间、案件定性等方面具有十分重要的意义。早、中期损伤时间的推断也一直是研究的重点与难点[17]。骨骼肌损伤后，机体通过分泌白细胞介素-1α（interleukin-1α，IL-1α）、IL-13、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）等炎症因子激活体内的炎症反应，进一步吞噬、清除坏死的肌组织[18-19]。目前关于筛选损伤时间推断的相关指标主要来自炎症反应[20-25]。炎症反应作为一种常见的全身反应，发生于多种基础疾病[26-27]，所以使用与炎症反应相关的指标推断损伤时间可能会受到基础疾病的影响。

现 有 研 究 结 果 证 明 ，Rae1[2]、Prr5[3-4]、Rcc1l[5，7]、Poldip3[8-9]4种基因编码的蛋白产物与细胞周期，细胞骨架的构建和分化，能量供给，蛋白质翻译等损伤后骨骼肌修复过程具有高度相关性。本研究采用RT-qPCR方法检测骨骼肌损伤后mRNA的相对表达量，同时结合HE染色结果，发现在损伤早期炎症细胞浸润不明显时，上述4种基因在表达模式上已经发生了变化，说明其参与了骨骼肌损伤修复过程，而且较为迅速。

目前关于损伤时间推断的研究主要是通过寻找损伤后单个相关指标在连续的时间段内的表达趋势，从本研究结果中单个指标在不同时间点的表达趋势来看，因为实验过程中各基因在提取及检测时存在各条件无法完全复制的情况，各指标在不同时间点的表达趋势并未体现出明显的规律性，所以通过单个基因在损伤后不同时间点的变化趋势来研究与损伤相关的时间规律具有一定的局限性。

本研究结果显示，4种基因在骨骼肌损伤后均呈高表达，且在部分时间点的表达倍数大于2，说明随着损伤时间的延长，相关基因的表达发生明显的变化。联合4种基因在各时间点的表达模式，同时结合组织病理学检验结果，将48h内的损伤时间初步划分为4～12h、16～28h、32～48h 3个时间段。

Fisher判别法是依据方差分析的思想，采用投影的方法，将处于高维度的数据投影至低维，是一种能较好区分各个分组的线性判别法。留一法交叉验证为顺序剔除一个样点，通过剩余的n-1个样点建立判别函数，再用建立好的判别函数对剔除的样点进行判别，重复n次后得到误判概率。本研究为了检验依据表达模式得到的上述3个分组是否准确，采用留一法交叉验证建立Fisher判别模型对分组进行验证，结果显示：4～12 h的准确率为83.3%，16～28 h的准确率为75.0%，32～48 h的准确率为73.3%。Fisher判别结果验证了联合4个指标在损伤后各时间点的表达模式所得到的分组具有较高的准确性。

通过本研究发现，单个基因的表达量在连续的损伤时间中不具有较强的规律性，这可能与实验过程中存在损伤误差或试剂误差等系统误差有关，所以联合多指标进行损伤时间推断可以降低系统误差对结果的影响，使结果更为准确。炎症反应作为一种全身反应，如果自身患有与炎症相关的基础疾病时，使用以上与骨骼肌修复相关的基因推断损伤时间还可能减少基础疾病对损伤时间推断的影响。同时联合多指标进行损伤时间推断，也使得到的结果具有更高的可信度，因此在后续的研究中，本课题组会加大相关基因的检测数量，进一步完善该方法在损伤时间推断中的应用，使其在损伤相关案件的鉴定中发挥实践作用。