免疫学实验教学中小鼠腹腔巨噬细胞化学染色实验方案改革的探索

王艳玲 李 哲 付海英

(吉林大学基础医学院,长春130021)

医学免疫学是生命科学和医学领域中具有较为完整的理论体系和技术体系的一门学科，是医学生的必修课程[1，2]。免疫学理论的主要内容是免疫系统的组成及功能，其中组成包括固有免疫和适应性免疫系统，相应的其功能为固有免疫应答和适应性免疫应答。免疫学实验课是免疫学教学的重要组成部分，是帮助学生理解基础知识、培养学生实践动手能力、提高学生综合素质的重要平台，对于培养学生的实践能力、科研思维等方面具有不可或缺的作用[3]。如何将实验课程与理论课程相联系，系统全面的培养学生对课程整体内容的理解一直是我们关注的重点。

在以往的实验课中，我们一直注重将实验课教学内容与理论内容紧密结合，分别检测固有免疫系统(如巨噬细胞等)和适应性免疫系统(如T、B淋巴细胞)的功能，以便于学生对理论知识的理解和巩固。然而多年教学中，在检测固有免疫系统中的巨噬细胞时，我们所采用的免疫细胞化学染色试验遇到了诸多的问题。为此，我们尝试采用自主制备多克隆抗体进行巨噬细胞的检测，得到了较好的效果。本文主要就前期存在的问题和改进的设想、方法的实施及成效进行阐述。

1 存在的问题和改进的设想

免疫细胞化学染色试验是用于检测免疫细胞数量及功能的常用方法。然而，在尝试开展小鼠腹腔巨噬细胞化学染色实验中出现了很多问题，从而影响了教学效果。主要包括以下几方面的问题:(1)检测靶点单一导致免疫染色效果不理想：实验中我们以抗小鼠巨噬细胞上的CD68分子为靶点，通过购置的抗CD68的单克隆抗体进行免疫细胞化学染色。由于该抗体只针对巨噬细胞上的一个分子标志，因此往往显色不明显，不易观察到阳性染色结果，不利于学生对实验结果进行准确判断。

(2)重复性差，结果不稳定：由于每学期课上使用的抗体往往来自于不同的生产批次，甚至有时是不同厂家，这导致了每次使用的抗体可能存在效价的不同，因此每次开课前实验教师都需提前进行多次预实验，以确定实验的条件，包括试剂的用量、反应的时间等。但仍常出现结果不稳定、重复性差等缺点，消耗了大量时间、人力、物力。

(3)成本较高：实验中选用的单克隆抗体，若选择进口抗体，效价比较高，并且检测效果也较理想，然而价格相对较高，而且采购周期较长，有时还可能影响正常课程进行。若选择国内厂家生产的抗体，其价格相对进口抗体低，但是抗体效价通常也比进口抗体低数倍以上，实验结果往往不理想，严重影响教学效果。

由此，我们设想能否自主研制针对巨噬细胞多种表位的多克隆抗体，以解决单克隆抗体的上述问题。

2 方法的实施

我们尝试以免疫学抗体制备的知识为基础，分离获得小鼠腹腔巨噬细胞作为免疫原，通过免疫家兔后收集血清，作为多克隆抗体，并用于小鼠腹腔巨噬细胞的免疫细胞化学染色试验，进行检测评价效果。具体的制备过程见图1。

(1)分离小鼠腹腔巨噬细胞:收集3～5只小鼠腹腔渗出液，经生理盐水洗涤离心后，置6孔细胞培养板培养2 h后，弃去上清，胰酶消化贴壁细胞，用APC-anti-F4/80抗体标记后流式细胞仪检测其纯度达94%(图2)，其余细胞收集备用。

图1 抗小鼠巨噬细胞多克隆抗体的制备流程Fig.1 Preparation of polyclonal antibody against mouse macrophages

(2)免疫家兔:实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性决定着制备出的免疫血清效价的高低[4]，因此我们选择家兔作为免疫对象，将收集获得的巨噬细胞与完全弗氏佐剂混合后，多点皮下注射至家兔体内，2 ml/只。初次免疫2周后，进行加强免疫，方法同初次免疫。加强免疫一周后进行肌肉注射再次免疫，分别在四肢进行，2 ml/只。

(3)分离血清:肌肉注射次日，颈动脉取血，室温静置2 h后，放4℃冰箱过夜，收集自然析出的血清，2 000 r/min离心10 min，收集上清(含抗小鼠巨噬细胞的多克隆抗体)。

(4)效价检测:取适量获得的血清进行不同浓度稀释，进行小鼠腹腔巨噬细胞免疫细胞化学染色试验，具体步骤见图3。

图2 小鼠腹腔巨噬细胞分离纯度检测鉴定Fig.2 Purity of isolated mouse peritoneal macrophageNote：A.Negative control；B.Macrophages labeled with PE-anti-F4/80.

图3 小鼠腹腔巨噬细胞免疫细胞化学染色实验步骤Fig.3 Protocol of immunocytochemical staining of mouse peritoneal macrophages

图4 两种抗体进行免疫细胞化学染色效果的对比Fig.4 Comparison of immunocytochemical staining effects between two antibodiesNote：A,D,F.Result of serial diluted commercial monoclonal antibody detection(1∶500,1∶1 000,1∶2 000)；B,E,G.Result of serial diluted homemade polyclonal antibody detection(1∶500,1∶1 000,1∶2 000)；C.Result of negative control.

3 改革成效

运用该方法取得了较好的检测结果，并且该方法具有以下几方面的优势。(1)检测阳性率高：与前期单克隆抗体检测结果进行比较，采用改良免疫细胞化学染色实验检测小鼠腹腔巨噬细胞的实验结果，显示自制的多克隆抗体能明显增加细胞阳性染色比例，且染色更加明显(图4)，利于结果观察和判断。并且采用自制的多克隆抗体稀释至2 000倍后仍能检测到巨噬细胞，而当商品化单克隆抗体稀释至该浓度时几乎无法检出(图3)。

(2)制备简单、来源方便:与单克隆抗体制备流程相比，多克隆抗体的制备相对简单，只需要获取免疫原，即小鼠腹腔巨噬细胞，进而免疫家兔后分离血清即可，不需要制备杂交瘤细胞及筛选单克隆细胞株等繁琐的过程，大大缩短了抗体的制备周期。

(3)成本降低、易于推广:采用改革后的方案，只需准备数只小鼠和家兔，自行操作即可获得实验用多克隆抗体。由于家兔体积较大，采血量多，因此免疫一只家兔即可获得足够量的抗体用于实验课。课前无需再购置价格昂贵的单克隆抗体，大大节约了实验成本。避免了商品化抗体采购周期长的问题，保证了抗体能及时应用于教学。

综上所述，此改良方法流程简单、容易操作，且不需要特殊的仪器和设备，只需能够进行实验动物操作和血清分离的实验室即可完成；结果判定简单，仅需普通光学显微镜下观察即可，因此可在大多数基础实验室推广开展。

4 结语

我们尝试了以小鼠腹腔巨噬细胞为抗原，通过免疫家兔，收集血清获得了抗小鼠腹腔巨噬细胞的多克隆抗体，并以此替代单克隆抗体进行免疫细胞化学染色试验，得到了较好的实验效果，相对于以往实验结果不稳定导致学生学习热情较低，改良后的方法可大大提高学生的兴趣，该方法可推广用于免疫学实验课的教学中，为在医学院校免疫学实践课中开展巨噬细胞的检测提供了必要的手段。