诺米林通过抑制TLR4/NF-κB 炎症通路减轻克雷伯菌老年肺炎大鼠模型炎症反应①

刘泽明 孙 颖 高玉春 龙怀聪 雷 霆 杜恒健

(西南医科大学附属医院感染科，泸州646000)

急性下呼吸道感染是老年人发病和致死的重要原因[1]。肺炎是指终末气道、肺泡和肺间质的炎症，是一种常见的下呼吸道感染引起的疾病，可由细菌、病毒、支原体等多种疾病微生物，放射线、吸入性异物等理化因素，免疫损伤，过敏及药物引起。其中细菌性肺炎是最常见的肺炎。肺炎是世界范围内传染病死亡的主要原因之一，死亡率高达20%～30%[2,3]。开发有效的肺炎治疗方法对人类医疗健康事业的发展至关重要。据报道许多天然产物在各类疾病治疗中具有积极作用。柠檬苦素类化合物是柑橘类水果如柠檬、橙子、佛手柚等种子、水果和果皮组织中高含氧萜类化合物的次生代谢产物，具有多种药理学活性，如抗癌、抗氧化、抗病毒及杀菌等[4]。柠檬苦素类化合物包括柠檬苦素、葛杜宁、黄柏酮及印楝素等。诺米林(Nomilin)是一种常见的柠檬苦素类化合物，具有抗癌细胞增殖、抗高血糖及减肥等功效[5,6]。但诺米林在肺炎中的作用还尚不清楚，有待进一步研究。本研究的主要目的是探究诺米林对克雷伯菌(Klebsiella)老年肺炎大鼠模型炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1材料 50只20～22月龄的SD大鼠购自中国科学院实验动物中心。克雷伯菌来源于中国生物制品检验鉴定所，菌株编号：K46114，用无菌生理盐水稀释到2×108ml-1。诺米林(分析纯)购自Sigma-Aldrich公司。苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色液和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick labeling,TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒购自Solarbio。白细胞介素(Interleukin,IL)-6、IL-1β和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor α,TNF-α)的酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司。PE-CD14抗体、抗CD14抗体、抗TLR4抗体、抗NF-κB P65和抗p-P65抗体购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1肺炎模型的建立 首先腹腔注射10%的水合氯醛0.35 ml/100 g麻醉大鼠后将大鼠四肢和牙齿固定于固定台上，用止血钳夹住大鼠的舌，固定于外，经上中切牙点悬挂。然后用注射剂钝圆针头经口插入气管，滴入克雷伯菌液0.28 ml/kg，此时感染的大鼠保持原位约10 min，使菌液充分流入肺泡内，以达到肺部感染的目的。对照组给予等量的生理盐水。第二天大鼠出现体温升高，躁动或少动，挠鼻，打喷嚏，呼吸急促，弓背，站立不稳，四肢瘫软，腹肌痉挛，饮食饮水下降等症状说明建模成功。

1.2.2动物分组及药物处理 大鼠随机分为5组：健康对照组(Ctrl)、克雷伯菌肺炎模型组、诺米林(10、25、50 mg/kg BW)治疗组，每组10只。除对照组外，其他组大鼠按上述方法接种克雷伯菌进行肺炎模型的建立。建模第二天开始给药，诺米林组腹腔注射10、25、50 mg/kg BW的诺米林，克雷伯菌肺炎模型组和对照组给予等量的生理盐水，连续给药7 d后进行后续实验。

1.2.3HE染色观察病理变化 连续给药7 d后用10%的水合氯醛0.35 ml/100 g麻醉大鼠后腹主动脉取血致死，开胸取肺组织，左肺用4%的多聚甲醛4℃下固定24 h。PBS清洗3次，再用30%、50% 和70% 的酒精依次脱水10 min。酒精脱水机中脱水，然后进行石蜡包埋切片，按照HE染色液说明书进行HE染色，显微镜下观察病理变化。

1.2.4TUNEL染色检测细胞凋亡 石蜡切片经二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化后用蛋白酶K于20～37℃下孵育15～30 min。PBS漂洗后用3%的H2O2于室温孵育20 min，再用PBS漂洗3次。然后按照试剂盒说明书进行生物素标记，显色，苏木素复染，自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。最后显微镜下观察拍照，细胞核呈棕色颗粒的为凋亡细胞。

1.2.5ELISA检测炎症因子水平 肺部组织于含蛋白酶抑制剂的裂解液中冰上匀浆，离心取上清，按照ELISA试剂盒说明书进行炎症因子水平检测。首先样品加入反应孔后37℃孵育45 min，洗涤液洗涤4次。然后加入生物素标记的抗体，37℃反应30 min，洗涤后加链霉亲和素-HRP，混匀后37℃反应30 min。最后加入显色剂避光显色15 min，再加终止液终止反应，450 nm处检测吸光值。

1.2.6流式细胞仪检测外周血CD14阳性细胞的比例 收集各组大鼠的外周血，加入红细胞裂解液,静置20 min,300 g离心5 min,去上清,用PBS清洗后制成1×106个/ml的单细胞悬液。然后加入荧光标记的单克隆抗体PE-CD14抗体，室温避光孵育30 min。然后PBS洗涤离心，再用10 g/L的多聚甲醛重悬细胞，放入流式细胞仪进行检测，用SSC和PE-CD14为横、纵的点图检测出CD14的阳性细胞比例。

1.2.7蛋白印迹检测蛋白水平 肺部组织于含蛋白酶抑制剂的裂解液中冰上匀浆后100℃变性5 min。然后等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜，5%的BSA封闭1 h后加入相应的一抗，4℃过夜孵育。再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h。最后加入发光液后于凝胶成像仪进行曝光拍照，统计灰度值计算相对表达量。

1.3统计学分析 用SPSS16.0软件对实验数据进行统计学分析，各组间进行单因素方差分析后再进行Duncan′s multiple ramge test检验。P<0.01为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1诺米林可改善克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部组织病变 通过HE染色观察诺米林对克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部组织病变的影响。图1显示，对照组大鼠肺组织中可见形态不规则、大小不等的管腔和空泡样结构，肺泡结构受到一定程度的破坏，气腔扩大，呈现轻微的肺气肿性肺退行性变化。没有纤毛上皮细胞坏死脱落、炎性细胞浸润等病理学改变。模型组大鼠肺组织结构受损，肺泡失去含气状态，充满大量纤维素和红细胞，部分肺泡融合，肺实质及支气管壁大量炎性细胞浸润，纤毛上皮坏死、脱落。诺米林(10、25 mg/kg)组大鼠肺部组织可见含气的空泡腔，气腔扩大，肺泡及管内可见少量炎性细胞浸润，但较模型组好转。诺米林(50 mg/kg)组大鼠肺部组织可见含气的肺泡腔，气腔扩大，气管黏膜上皮排列整齐，无明显的炎性细胞浸润。上述结果表明，诺米林可改善克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部组织病变。

2.2诺米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部组织细胞凋亡 利用TUNEL染色检测细胞凋亡，分析诺米林对克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部组织细胞凋亡的影响。如图2所示，模型组大鼠肺部组织细胞凋亡高于对照组(P<0.01)。诺米林(10、25、50 mg/kg)组大鼠肺部组织细胞凋亡低于模型组(P<0.01)。由此可见，诺米林可减弱克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部组织细胞凋亡。

2.3诺米林可减轻克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部组织炎症反应 为分析诺米林对克雷伯菌老年肺炎大鼠炎症反应的影响，通过ELISA检测肺部组织IL-6、IL-1β和TNF-α水平。由图3可知，模型组大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α水平高于对照组(P<0.01)。与模型组相比，诺米林(10、25、50 mg/kg)组大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α水平下降(P<0.01)。以上结果说明，诺米林可减轻克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部组织炎症反应。

图1 HE染色观察肺部组织病变Fig.1 Pathological changes of lung tissues were observed by HE staining

图2 TUNEL染色检测细胞凋亡Fig.2 Apoptosis was detected by TUNEL stainingNote：*.P<0.01 vs control group；#.P<0.01 vs Klebsiella model group.

图3 ELISA检测炎症因子水平Fig.3 Levels of inflammatory factor were measured by ELISANote：*.P<0.01 vs control group；#.P<0.01 vs Klebsiella model group.

图5 蛋白印迹检测TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达Fig.5 Expression of TLR4/NF-κB pathway related proteins were detected by Western blotNote：*.P<0.01 vs.control group；#.P<0.01 vs.Klebsiella model group.

图4 流式细胞术检测外周血中CD14阳性细胞比例Fig.4 CD14 positive cell rate in peripheral blood was tested by flow cytometryNote：*.P<0.01 vs control group；#.P<0.01 vs Klebsiella model group.

2.4诺米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠外周血中CD14阳性细胞的比例 通过流式细胞分选技术分析诺米林对克雷伯菌老年肺炎大鼠外周血中CD14含量的影响。图4显示，模型组大鼠外周血中CD14阳性细胞数比例高于对照组(P<0.01)。与模型组相比，诺米林(10、25、50 mg/kg)组大鼠外周血中CD14阳性细胞数比例降低(P<0.01)。上述结果表明，诺米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠外周血中CD14阳性细胞的比例。

2.5诺米林对克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部组织TLR4/NF-κB 炎症通路的影响 为分析诺米林对克雷伯菌老年肺炎大鼠TLR4/NF-κB 炎症通路的影响，蛋白印迹检测肺部组织CD14、TLR4、NF-κB P65和p-P65的蛋白水平。如图5所示，模型组大鼠CD14和 TLR4表达及p-P65/P65蛋白比值高于对照组(P<0.01)。与模型组相比，诺米林(10、25、50 mg/kg) 组大鼠CD14和 TLR4表达及p-P65/P65蛋白比值下降(P<0.01)。由此可见，诺米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部组织CD14和 TLR4表达及NF-κB P65磷酸化水平，抑制TLR4/NF-κB 炎症通路的活化。

3 讨论

目前对细菌性肺炎患者一般采用抗生素经验性治疗，如用β-内酰胺联合大环内酯类药物，呼吸氟喹诺酮类原料药或四环素；或者选者一些新的抗菌药物，如替加环素和头孢洛林。然而随着抗生素的广泛使用，各种耐药菌株也不断增加， 且产生超广谱酶，这给医生在选择抗生素方面提出了很大挑战[7]。挖掘肺炎新的有效的治疗方法已成为研究热点。越来越多的研究表明植物提取物在各种疾病治疗中发挥着积极作用。

大量文献报道植物提取物具有改善各种疾病中组织病变的功效。有数据显示草木犀提取物可改善盲肠结扎穿孔术诱导的肺损伤大鼠水肿及炎性细胞浸润等病理变化[8]。Sohn等[9]发现香芋提取物可减轻H1N1病毒诱导的急性肺损伤小鼠肺部组织炎性细胞浸润及杯状细胞增生等病变。有研究显示柠檬苦素可缓解D-半乳糖胺诱导的肝损伤大鼠肝脏组织门静脉单核细胞浸润、组织水肿、纤维化等病理变化[10]。据报道黄柏酮可改善博来霉素诱导的小鼠肺组织纤维化及炎性细胞浸润等病变[11]。本研究利用老年大鼠克雷伯菌肺炎模型，发现诺米林可减轻肺泡破坏、炎症细胞浸润、纤毛上皮坏死脱落，从而改善肺炎病理改变。

肺炎过程中常常会出现细胞凋亡的增加[12]。越来越多的数据表明植物提取物可逆转各类疾病中异常的细胞凋亡。有研究发现非洲桃花心木的柠檬苦素类化合物可抑制对乙酰氨基酚诱导的肝细胞凋亡，发挥肝细胞保护的作用[13]。据报道儿茶的树皮提取物可减弱苯并芘诱导的肺毒性小鼠Bax和Caspase-3表达，提高Bcl-2表达，抑制细胞凋亡[14]。有数据显示在缺血再灌注大鼠中，柠檬苦素可降低Caspase-3的活性[15]。本文结果表明，诺米林可减弱克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部组织细胞凋亡。

炎症反应的增强是各类疾病的常见特征，大量研究表明许多植物提取物具有抗炎功效。Ahmad等[16]发现葡萄籽原花青素提取物可抑制卡拉胶诱导的小鼠肺部组织ICAM-1、IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1的表达。据报道在香烟烟雾冷凝物联合脂多糖诱导的小鼠肺部炎症模型中，蛇床子提取物可降低TNF-α、IL-6和MIP-2的水平[17]。有数据显示葛杜宁减弱酵母聚糖诱导的关节炎小鼠TNF-α、IL-6和PGE2表达[18]。有研究表明印楝素可降低角叉菜胶诱导的足肿胀小鼠TNF-α的表达[19]。据报道诺米林可减弱TNF-α诱导的人主动脉平滑肌细胞IL-1β、IL-4和 IL-6的释放[20]。Pratheeshkumar等[21]发现诺米林可抑制黑色素瘤荷瘤小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌。本研究结果显示，诺米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α水平，缓解炎症反应。

TLR-4/NF-κB通路在各类疾病的炎症反应中具有重要的调控作用[22]。有研究表明LPS可激活急性肺损伤小鼠中肺脏的气道上皮和肺泡隔膜细胞TLR-4通路，肺脏中的巨噬细胞会分泌各种炎性细胞因子导致炎症反应的增强,越来越多的文献报道植物提取物可调节TLR-4/NF-κB通路[23,24]。有研究发现隐丹参酮可减弱脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞CD14和TLR4的表达[25]。黄杞苷可降低脂多糖诱导的子宫内膜炎小鼠TLR4和细胞核内NF-κB P65水平，抑制NF-κB通路活化[26]。Yang等[27]发现黄芪提取物可抑制卵清蛋白诱导的支气管哮喘小鼠NF-κB通路活化。据报道葛杜宁可通过TLR-4介导的信号通路降低脂多糖诱导的小鼠炎症反应[28]。本文结果显示，诺米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠外周血中CD14含量，减弱肺部组织CD14和 TLR4表达及NF-κB P65磷酸化水平，抑制TLR4/NF-κB 炎症通路的活化。

综上所述，在克雷伯菌老年肺炎大鼠模型中，诺米林可改善肺部组织病变，减弱细胞凋亡，抑制IL-6,IL-1β和TNF-α水平，降低外周血中CD14含量，减弱肺部组织CD14和 TLR4表达及NF-κB P65磷酸化水平。诺米林还可通过抑制TLR4/NF-κB 炎症通路的活化缓解克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部组织病变、细胞凋亡及炎症反应。下一步将研究诺米林对其他类型的肺炎如病毒性肺炎的影响，为肺炎的治疗提供参考。