慢性心理应激导致小鼠γδT细胞数目减少①

黄晓峰 侯春梅 余海韵 杜盈莹 孙 茗 张纪岩 林 周

(军事科学院军事医学研究院军事认知与脑科学研究所,北京100850)

γδT细胞同αβT细胞一样在胸腺中发育，属于非经典T细胞的一个小亚群，通过模式识别受体识别多种微生物产物后扩增并释放细胞因子，从而起到人体第一道免疫防线的作用[1,2]。我国正处于快速发展的转型期，社会心理问题日益突出。慢性心理应激会导致下丘脑-垂体-肾上腺轴持续活化，应激激素糖皮质激素和儿茶酚胺水平持续升高[3-9]，进而导致经典T淋巴细胞凋亡性减少，这可能是长期的精神压力和情绪低落导致机体对于细菌和病毒感染的抵抗力下降的原因[4]。慢性心理应激如何影响γδT细胞还不清楚。我们对此进行了探讨。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 6～8周龄雌性C57BL/6小鼠购自中国军事医学研究院实验动物研究所，所有小鼠均在无特定病原体条件下饲养，所有手术均在戊巴比妥钠麻醉下进行，并尽一切可能减少实验动物的痛苦。该方案得到了军事认知与脑科学研究所的批准。本研究中对小鼠的饲养、使用和治疗均符合军事认知与脑科学研究所制定的实验动物使用指南。

1.1.2仪器和试剂 FACS Calibur型流式细胞仪,美国BD公司;普萘洛尔(Propranolol)、米非司酮(RU486)、多聚甲醛和叠氮钠购自西格玛化学公司；糖皮质激素地塞米松(Dexamethasone)购自MP Biomedicals公司；抗小鼠CD3和 抗小鼠γδTCR的荧光结合抗体购自eBioscience公司；凋亡试剂盒购自BioLegend公司。

1.2方法

1.2.1限制性束缚应激 按照随机方法将小鼠分为束缚组和对照组。束缚组每只小鼠束缚在规格相同的通风良好的50 ml锥形管中，连续束缚5个晚上，时间为下午17:00到次日早上09:00。在每个约束循环之间清洁和消毒束缚管。小鼠可以在管子里来回移动，但不能转身。对照组小鼠虽然不受束缚，但在相同时间段内禁食禁水。为了探讨糖皮质激素的作用，每次束缚应激期前1 h给实验组小鼠腹腔注射25 mg/kg RU486(溶于丙二醇/乙醇 7/3 v/v)。对照组注射相同体积的丙二醇/乙醇(7/3 v/v)。为了探讨儿茶酚胺的作用，在每个束缚应激期前1 h给实验组小鼠腹腔注射溶于0.9%生理盐水的10 mg/kg普萘洛尔或相同体积的0.9%生理盐水。

1.2.2流式细胞术 单细胞悬浮液在含有0.1%叠氮化钠和2%FBS的PBS中在冰上与荧光结合抗体避光孵育30 min。同型抗体作为阴性对照。样品细胞在染色缓冲液中清洗一次，然后在含有1%(w/v) 多聚甲醛的PBS中固定细胞并在4°C下避光保存。在Becton-Dickinson FACS Calibur machine 流式仪(BD Biosciences)上进行流式细胞术分析。

1.2.3细胞凋亡分析 为了研究慢性心理应激对小鼠体内γδT细胞凋亡的影响，将脾的单细胞悬浮液在含钙离子的300 μl结合缓冲液中重新悬浮，用抗CD3-PE、抗γδTCR-APC和Annexin V-FITC对其进行染色。通过流式细胞术分析Annexin-V染色的CD3+γδTCR+细胞凋亡情况。为了分析糖皮质激素是否直接诱导γδT细胞凋亡，流式分选γδT细胞。在用或不使用0.1 mg/ml糖皮质激素孵育24 h后，将两组细胞悬浮于300 μl含有钙离子的结合缓冲液中，用抗CD3-PERCP、抗γδTCR-FITC、PI和Annexin V-APC对γδT细胞进行染色。通过流式细胞术分析Annexin V/PI染色的CD3+γδTCR+细胞凋亡情况。

2 结果

2.1限制性束缚导致小鼠胸腺和脾脏的器官重量和细胞数量减少 限制性束缚引发持续的生理和心理压力反应，但对免疫器官的影响尚不清楚。本研究发现连续5次16 h/次束缚对体重没有显著影响(图1A)，但导致胸腺和脾脏萎缩(图1B)。统计显示胸腺和脾脏的重量显著下降(图1C)、胸腺细胞和脾细胞的数量显著减少(图1D)。因此，采用该束缚方法导致小鼠免疫器官受到严重影响。

2.2限制性束缚导致γδT细胞数量减少 本研究分析了胸腺、脾脏和肠系膜淋巴结中 CD3+γδTCR+的γδT细胞的百分比和数量。流式细胞术显示，在应激小鼠的胸腺中，较为成熟的CD3+γδTCR-传统T细胞和CD3+γδTCR+γδT细胞的百分比都有所增加，后者增加的幅度较小(图2A)。因为应激小鼠胸腺中的总细胞数显著减少，CD3+γδTCR-和CD3+γδTCR+细胞的绝对数都下降，γδT细胞绝对数的减少更为显著(图2B)。在脾脏和肠系膜淋巴结中，γδT细胞的百分比和数量的减少程度与CD3+γδTCR-传统T细胞相似(图2C～F)。

2.3糖皮质激素的外周作用导致应激小鼠γδT细胞数量减少 慢性心理应激与糖皮质激素和肾上腺激素的升高有关，但糖皮质激素和肾上腺素对于γδT 细胞是否有直接影响尚不清楚。为此，本研究首先对束缚组小鼠进行糖皮质激素拮抗剂RU486的全身给药。实验结果表明，束缚前对小鼠进行RU486处理能显著逆转胸腺、脾脏和肠系膜淋巴结中γδT细胞数量的减少(图3)。

图1 限制性束缚对小鼠胸腺和脾脏的器官重量和细胞数量的影响Fig.1 Effects of five 16 h restraint sessions on the organ weight and cell numbers of mouse thymus and spleenNote:The body weight was measured (A) and the thymus and spleen were isolated (B).Then the weight (C) and cell numbers of thymus and spleen (D) were measured.Results are expressed as

图2 限制性束缚对γδT细胞数量的影响Fig.2 Effects of five 16 h restraint sessions on number of γδT cellsNote：Mononuclear cells from the thymus,spleen and mesenteric lymph nodes were subjected to flow cytometry for CD3 and γδTCR staining.A,C,E.Representative data；B,D,F.Absolute numbers.Results are expressed as

图3 糖皮质激素受体抑制剂对γδT细胞数量下降的影响Fig.3 Effects of glucocorticoid receptor inhibitor on reduction of γδT cell numbers after five 16 h restraint sessionsNote：Percentages and cell numbers of γδT cells in immune organs.A.Represent date;B-D.Absolute numbers.Mononuclear cells from the thymus,spleen and mesenteric lymph nodes were subjected to flow cytometry for CD3 and γδTCR staining.Results are expressed as

2.4儿茶酚胺在应激小鼠γδT细胞数量减少中的作用不明显 为了分析儿茶酚胺在慢性心理应激条件下γδT细胞减少中的作用，每次束缚前对小鼠进行普萘洛尔全身给药，试验结果表明，在5次束缚后，普萘洛尔对γδT细胞的减少几乎没有影响(图4)。

图4 β肾上腺素能受体抑制剂对γδT细胞数量下降的影响Fig.4 Effects of beta-adrenergic receptor inhibitor on reduction of γδT cell numbers after five 16 h restraint sessionsNote：Mononuclear cells from the spleen and mesenteric lymph nodes were subjected to flowcytometry for CD3 and γδTCR staining.A.Representative data；B and C.Absolute numbers.Results are expressed as

图5 糖皮质激素对γδT细胞凋亡的影响Fig.5 Effects of glucocorticoid on apoptosis of γδT cellsNote：A-C.γδT cells were isolated from single-cell suspensions of the spleen.The purity of γδT cells was about 70% as confirmed by flow cytometry (A).After incubation with or without 0.1 mg/ml glucocorticoid for 24 h,apoptosis of γδT cells was assessed by flow-cytometric analysis of Annexin-V/PI staining in CD3+γδTCR+ cells；D-F.C57BL/6 mice were subjected to five 16 h restraint sessions or left untreated,n=3.Mononuclear cells from the spleen were subjected to apoptosis analysis for Annexin-V staining in CD3+γδTCR+ cells.B，D and E.Representative data；C and F.Statistical data expressed as

2.5糖皮质激素直接诱导γδT细胞凋亡 为了探索糖皮质激素是否像在传统T细胞中那样诱导γδT细胞凋亡，我们从脾脏中纯化了γδT 细胞。如流式细胞术所证实，γδT细胞的纯度约为70%(图5A)。在用或不使用0.1 mg/ml糖皮质激素孵育24 h后，通过流式细胞术分析Annexin-V/PI染色的CD3+γδTCR+来评估γδT 细胞的凋亡情况。如图5B和5C所示，糖皮质激素可以在体外直接诱导γδT细胞凋亡。与对照组小鼠相比，应激组小鼠脾脏中的γδT细胞凋亡率始终高于对照组小鼠(图5E和5F)。

3 讨论

有文献报道提示肠黏膜中γδT细胞在应激压力下数量减少[10]。在这项工作中，我们发现在慢性心理应激状态，胸腺、脾脏和肠系膜淋巴结中γδT细胞减少。因此，γδT细胞非常容易受到心理压力的影响，类似于传统的T细胞。 慢性心理应激与持续升高的应激激素(如糖皮质激素和儿茶酚胺)水平有关[3,6]。我们发现全身给予糖皮质激素受体抑制剂RU486逆转γδT细胞数的降低，而β肾上腺素能受体抑制剂普萘洛尔对γδT细胞的减少几乎没有影响。因此，在慢性心理应激过程中，糖皮质激素的作用应该比儿茶酚胺更重要。此外，糖皮质激素在体外直接诱导纯化的γδT细胞凋亡，这与应激小鼠脾脏中γδT细胞的凋亡增强一致。因此，慢性心理应激通过糖皮质激素导致γδT细胞凋亡。γδT细胞是人体抗感染免疫第一道防线的关键组成成分[2]。慢性心理应激导致生物宿主对细菌和病毒感染的防御能力下降。因此，上述的研究结果表明，慢性心理压力下γδT 细胞的减少降低了生物宿主抵抗各种感染的能力。