精子印记基因甲基化和胎停育关系的病例对照研究

刘志朝 杨 佳 王 莉 强 梅

山西医科大学公共卫生学院 (太原 ，030001)

胎停育是指孕早期胚胎发育自然终止及胚胎丢失的病理过程[1]。其发生与环境、内分泌、染色体、免疫系统及心理卫生等因素有密切关系，但仍有50%的病因尚未阐明[1]。不良妊娠结局的表观遗传学异常研究已成为近年来生殖与发育研究的前沿领域[2]。动物研究表明印记基因的敲除与胚胎发育有关[3]。作为一种表观遗传学修饰，DNA甲基化可以控制印记基因的表达[4]。精子的印记基因的甲基化修饰又能稳定遗传给子代[5]。故本研究通过分析胎停育与精子印记基因H19、Peg3、Meg3甲基化之间的关系，探索胎停育发生的可能表观遗传学机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2015年3-4月和2016年3-4月，使用方便抽样的方法选择本院生殖中心行孕前检查的已婚男性。入选标准：22～60岁已婚男性。排除标准：家族有遗传病史、不育史者；精液<0.5ml)。通过自行设计的问卷，包括人口学特征、生活习惯和心理健康状况等。由经过培训的调查员对入选者进行面对面访谈，签署知情同意书。男性就诊者禁欲3～7d，手淫法收集全程精液。因为经费有限，从信息比较全的对象中用方便抽样的方法选取442份精液样本进行DNA提取及甲基化检测。以此为基线，从随访档案记录或通过电话随访其配偶妊娠情况及结局。截至2018年3月，共得到394个随访结果。其中胎停育35例，作为胎停育组；配偶分娩正常活产儿144例，从中通过1:1配对选取35例作为对照组。匹配条件：年龄相差不超过6岁；体质量指数(BMI)相差不超过6 kg/m2；吸烟情况一致；饮酒情况一致；受孕方式一致。正常活产儿：足月(孕周≥37周)、新生儿出生体重正常(≥2500～≤4000g)和无先天畸形。吸烟：≥1支/d，且持续1年以上。饮酒：≥1次/周，每次≥2两，且持续1年以上。受孕方式包括自然妊娠和辅助生殖(IVF/ICSI)。

1.2 精子DNA中H19、Peg3和Meg3印记基因甲基化水平的检测

采用异硫氰酸胍法[6]提取精子DNA；用EZ Methylation Gold-Kit试剂盒 (Zymo Research, Orange, CA, 美国)进行亚硫酸氢盐处理；用PyroMark PCR Kit试剂盒(Qiagen，CA, 美国)进行PCR扩增；再经单链PCR产物纯化、测序引物杂交等步骤后使用PSQ96 焦磷酸测序仪 ( Biotage AB, Uppsala, 瑞典)及 PyroMark Gold Q96 kit试剂盒(Qiagen, CA, 美国)对H19、Peg3、Meg3的目的片段进行甲基化水平的检测。本研究选取H19、Peg3和Meg3的DMR进行分析，分析的CpGs位点数目分别为H19 7个、Meg3 8个、Peg3 8个。PCR引物序列见表1；PCR扩增后的电泳结果见图1。

表1 PCR 扩增的引物信息

*生物素标记的引物

(DNA分子量标记条带从下至上依次为100bp，150bp，300bp，450bp)图1 印记基因H19、Peg3和Meg3的PCR扩增后的电泳图

1.3 统计分析

采用IBM SPSS 24.0进行统计分析。使用配对t检验对两组间年龄和BMI进行比较；使用K-S检验对DNA的H19、Meg3、Peg3平均甲基化水平及各位点甲基化水平进行正态性检验，除H19的CpG3甲基化服从正态分布(P=0.2)，其余均不服从正态分布(P<0.05),使用Wilcoxon符号秩和检验分析配对的两组精子印记基因甲基化水平的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 基本特征比较

研究对象共35对，年龄25～45岁，配对年龄相差3岁以内27对(77%)，年龄相差4～6岁8对(23%)，两组差异无统计学意义(t=0.233,P=0.817)。体质指数(BMI)相差3kg/m2以内31对(89%)，相差4～6kg/m2共4对(11%)，差异无统计学意义(t=0.113,P=0.911)。吸烟21对(60%)。饮酒8对(23%)；自然妊娠19对(54%)，辅助生殖(IVF/ICSI)15对(46%)。

2.2 印记基因平均甲基化水平比较

两组精子的H19、Peg3和Meg3甲基化水平比较无差异(P>0.05)。见表2。

2.3 印记基因各CpG位点甲基化水平比较

由于平均甲基化水平由各CpG位点组成，平均甲基化水平可能掩盖某些CpG位点间的变化，因此将对照组和胎停育组精子的H19的7个、Peg3的7个和Meg3的8个CpG位点分别进行Wilcoxon符号秩和检验，胎停育组的Meg3的CpG3位点和CpG6位点甲基化水平显著性减少(P<0.05)。其余CpG位点组间比较无统计学差异(P>0.05)。去除极端值(n=4)后，发现胎停育组的Meg3的CpG3位点还是显著减少(P<0.05)，而Meg3的CpG6位点甲基化水平组间比较无统计学差异(P<0.05)。提示精子Meg3的CpG3位点甲基化水平的改变与胎停育发生有关联。见表3。

表2 两组印记基因平均甲基化水平比较[%，M(P25，P75)]

表3 两组印记基因各CpG位点甲基化水平比较[% ， M(P25，P75)]

*两组比较P<0.05

3 讨论

有研究指出印记基因H19与胎盘的形成和胚胎发育有关，敲除H19会导致胚胎死亡[3]。目前，关于人类H19基因与精液质量的研究相对较多，如李建波等[7]发现H19甲基化水平与少精子症和精子浓度有关，H19可能通过影响精子质量影响胚胎发育。因此本研究通过匹配受孕方式减少精子质量对结果的影响。Ankolkar等[8]的研究发现反复自发性流产组中研究对象精子的H19印记基因甲基化水平低于对照组。然而，在本次选用的人群样本研究中，未观察到胎停育与精子H19印记基因甲基化水平有关。胎停育发生的病因尚未明了，其与遗传和环境关系极为复杂，需要进一步研究揭示。

Peg3是一个父系表达的印记基因，有研究显示，敲除小鼠Peg3基因可导致胎盘异常、生殖能力及辅助行为缺陷、代谢异常和自主吸奶等行为缺陷[9]。以往的动物研究中敲除Peg3的DMR的雄鼠与正常雌鼠结合后，胚胎死亡与低出生体重小鼠的发生率上升[10]。胎盘Peg3 mRNA的高表达可能使巨大胎儿的发生率上升[11]。但是本次选用的人群样本的研究中，未观察到胎停育组与对照组精子Peg3印记基因甲基化水平的差异 。可能是人群研究更为复杂，有待于进一步探讨。

Miyoshi等[12]在2000年发现小鼠Glt2的人类同系物，命名为Meg3。雌鼠此基因的敲除导致围产期小鼠死亡和骨骼肌缺陷，表明小鼠Meg3在胚胎发育中有重要作用[13]。本次选用的人群样本研究中，发现胎停育组Meg3的CpG3位点甲基化水平显著低于对照组，说明精子Meg3甲基化水平与胚胎发育有关。前期研究表明，Meg3的DMR低甲基化会导致Meg3表达升高，例如，培养肝癌细胞的过程中加入甲基化抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR) 后Meg3的表达显著增加[14]。而Meg3的表达与细胞增殖呈负相关，Meg3高表达抑制细胞增殖[15]。因此Meg3的低甲基化可能通过使Meg3的表达升高而抑制胚胎细胞的增殖与分化，从而影响胚胎正常发育。

就样本量来说，因为关于印记基因甲基化水平对胎停育的危险性的研究很少，尤其是某些印记基因的甲基化水平高或者低是否是胎停育的危险因素的结论尚不能判定，OR值难以估计，所以样本量不易计算。参考先前类似研究的样本量，如Ankolkar等[8]的研究有23个病例和23个对照，Vidal等[16]的研究中有19个病例和60个对照，因此本研究用35个病例和35个对照进行分析。同时，本研究利用可供选择的对照多的优势(n=144)，对一些因素进行了匹配，减小了混杂因素的影响，并且提高了研究效率。但是匹配的变量与所研究的变量之间的交互作用未能考虑，这是本研究的局限性。表观遗传学改变容易受环境因素的影响，因此进一步的研究应该对同一个时间内研究对象的精液样本中印记基因甲基化水平与相关的环境改变和发育状况之间的相关性作比较。