大别山冬青离体快繁技术

方宇鹏, 戴启培

(池州职业技术学院 园林系,安徽 池州 247000)

大别山冬青(IlexdabieshanensisK.Yao & M.B.Deng)，又名霍山冬青，为冬青科(Aquifoliaceae)冬青属(Ilex)阔叶常绿乔木，是我国特有的植物,原产于安徽省西部的大别山地区，在海拔150～470m的沟边及山坡路边野生生长。其果实红艳，叶色翠绿，生长势极强，且耐修剪，耐瘠薄干旱，有很强的适应性，是珍贵的园林绿化树种。此外，大别山冬青可制作保健饮料苦丁茶，具有降脂及消炎等药用保健的功效，有十分广阔的市场应用前景[1,2]。池州职业技术学院于2013年开始对大别山冬青扦插繁殖进行研究，但繁殖系数低。目前所繁殖植物仅用于苦丁茶制作，园林应用尚未有报道。为开发推广利用大别山冬青这一种质资源，本文在前人研究的基础上，运用正交试验法，筛选并建立大别山冬青离体快繁体系，以期为实现大别山冬青工厂化育苗、加快其推广应用等方面提供理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为安徽省安庆市太湖县宏安冬青树种植农民专业合作社提供的5年生扦插苗。2017年5月中旬取无病虫害、生长健壮的当年生枝条。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的消毒处理 用自来水将具有腋芽的一年生枝条冲洗30min，然后去除叶片，留少量叶柄，放入盛有洗衣粉溶液的烧杯中漂洗，并不断搅动，洗净后沥干，移至超净工作台上。75%的酒精消毒20s后用无菌水冲洗5次后，再将其放于0.1%的升汞液中消毒8min，然后用无菌水冲洗3～5次，最后将茎段表面的水分用无菌纸吸干[3,4]。最后将经过消毒的茎段(外植体)剪切成约0.5～1.0cm长的茎段，每茎段带1～2个腋芽，接种到初代培养基上诱导腋芽萌发。

1.2.2 腋芽诱导培养 通过L9(33)的正交试验法，将培养基设计为9个不同的组合，最终筛选出最佳大别山冬青的芽诱导培养基组合。正交试验中所用基本培养基为WPM、B5和MS,细胞分裂素NAA的质量浓度分别设为0、0.3及0.5mg·L-1,而6-BA的质量浓度分别设为0.5、1.0及1.5mg·L-1。每个培养瓶中分别接种3个茎段，每种试验处理分别接种10瓶，重复三次。外植体接种后置于(23±3)℃，光照2000Lx，16h/d的条件下培养。观察腋芽的生长状况,培养30d后开始统计各处理的诱导率和其新稍的长度。利用正交设计的相关软件助手对统计的数据进行分析，以此筛选大别山冬青最佳的诱导培养基组合。

1.2.3 继代增殖培养 前期初代培养诱导后产生的新梢，经过切割处理后转接到含不同浓度配比生长调节剂的增殖培养基中。根据外植体在不同处理下初代培养基中诱导分化情况，以MS培养基为继代增殖培养基，并添加6-BA及IBA作为生长调节剂，其浓度配比分别为：6-BA设0.5mg·L-1和1.0mg·L-1，IBA设0.3mg·L-1和0.5mg·L-1。将经过初代培养后的嫩梢进行切割，随机接种到不同的继代增殖培养基中，每瓶2个茎段，各茎段带一个新腋芽。每个处理接种10瓶，重复三次，培养周期为30d。观察芽增殖情况，计算大别山冬青丛生芽增殖率，筛选最佳继代增殖培养基。

1.2.4 生根培养 将长至3～4cm高的健壮大别山冬青试管苗接种到4种生根培养基上进行生根诱导：(1)1/2MS+NAA0.1mg·L-1+IBA1.0mg·L-1；(2)1/2MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.5mg·L-1；(3)1/2MS+NAA0.5mg·L-1+IBA1.0mg·L-1；(4)1/2MS+NAA0.5mg·L-1+IBA0.5mg·L-1。观察根系生长情况，40d统计生根率，从中筛选最佳生根培养基。

1.2.5 炼苗移栽 大别山冬青生根后的组培苗株高4cm左右时可进行炼苗与移栽。选择根系发达、生长健壮的组培苗，先将瓶盖打开，覆上保鲜膜在人工气候室内放2～3d。再从培养瓶中取出小苗，洗除根部的培养基，移栽至消毒过的泥炭土、珍珠岩和蛭石混合的基质中。前期适当遮阴，保持一定的湿度，25d后统计成活率。

1.3 数据处理与分析

利用Excel作图后进行数据分析和处理，方差分析采用SPSS18.0软件。

2 结果与分析

2.1 培养基及生长调节剂浓度对初代培养的影响

大别山冬青接种15d后，各处理腋芽均有一定程度的膨大，25d后观察发现有腋芽萌发。由表1中数据可见，三个因素中(细胞分裂素NAA的质量浓度、基本培养基和6-BA的质量浓度)，影响大别山冬青生长及其腋芽萌发的主要因素为6-BA质量浓度的高低，基本培养基种类影响次之，而细胞分裂素NAA的质量浓度对初代培养影响最小。此外，由表1可知，大别山冬青腋芽萌发率及新稍的生长随着6-BA质量浓度的升高，呈先增加后降低的趋势。三种培养基对大别山冬青腋芽的萌发都具有一定的诱导作用，但其中WPM培养基的诱导效果不明显。通过不同的试验处理及结果分析可见，大别山冬青腋芽诱导最佳的培养基为MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.3mg·L-1，其腋芽诱导率高达100%。

表1 培养基及生长调节剂对大别山冬青腋芽的诱导影响

2.2 不同质量浓度的生长调节剂对大别山冬青继代培养的影响

将大别山冬青初代培养后的新芽通过继代接种到增殖培养基中，培养基中含不同浓度的生长调节剂。通过继代培养30d后，对丛生芽的增殖情况进行统计。结果发现，不同浓度的生长调节剂组合对大别山冬青丛生芽增殖的影响差异显著。

由表2分析可见，大别山冬青经初代培养后的嫩枝接种在不同质量浓度的IBA和6-BA配比的MS培养基上时，随着6-BA质量浓度的升高，大别山冬青的增殖系数呈升高趋势。当IBA质量浓度为0.5mg·L-1时，增殖效果不明显。当6-BA质量浓度为1.0mg·L-1、IBA质量浓度为0.3mg·L-1时，增殖效果最好，与其它处理间呈显著差异。因此，大别山冬青丛生芽增殖的最佳培养基为MS+6-BA1.0mg·L-1+IBA0.3mg·L-1。

2.3 大别山冬青组培苗生根培养

将高3～4cm健壮生长的大别山冬青试管苗分别接种到含不同生长调节剂的生根培养基中进行诱导生根处理。培养15d后观察可发现，大别山冬青组培苗开始产生不定根；25d后可见大量须根。由表3可见，不同质量浓度的生长调节剂NAA和IBA可在一定程度上诱导大别山冬青组培苗生根。但当NAA质量浓度为0.1mg·L-1，IBA质量浓度为0.5mg·L-1时，生根率相对较低，生根所需时间长，平均根长短，不定根数量较少；随着生长调节剂NAA的质量浓度增加，大别山冬青的生根率及不定根的数量呈升高趋势，且最长根长和平均根长也逐渐增加。当生根培养基中添加0.3mg·L-1的NAA和0.2mg·L-1的IBA时，大别山冬青的组培苗诱导生根率高达95%，不定根数量达6.8条，平均根长达2.6cm，不定根数量及平均根长均与其他处理间差异显著。因此，从综合生根率及根系质量可知，最适宜大别山冬青组培苗生根的培养基是1/2MS+NAA0.3mg·L-1+IBA0.2mg·L-1。

表2 不同质量浓度的生长调节剂对大别山冬青继代增殖的影响

注：增殖系数统计结果为平均值±标准差，其中差异显著(p<0.05)以小写字母表示。下同

Notes：The multiplication coefficient is average value ± standard deviation.The significant difference(p<0.05)was expressed in different lower letters

表3 生长调节剂浓度对大别山冬青组培苗根的诱导影响

2.4 大别山冬青组培苗驯化移栽

大别山冬青生根后的组培苗长至4cm高时，将根系发达、生长健壮的组培苗，经驯化后移栽至消毒过的蛭石(V)：珍珠岩(V)：泥炭土(V)按2:1:2混合的基质中，控制外界环境条件，移栽后25d，植物长势良好，成活率可达85%。

3 结论与讨论

大别山冬青是园林绿化中一种珍贵的优良树种，在保健饮料中还可制作为苦丁茶，具很好的降脂、消炎等保健和药用功效，有很好的的市场开发效益及广阔的应用前景。通过对大别山冬青的组织培养技术进行研究，可快速增加大别山冬青的繁殖系数，对大别山冬青种质资源的利用及创新应用有重要意义。目前，市场上大别山冬青主要通过扦插进行繁殖,但扦插繁殖系数较低，且受生长季节等外界环境条件影响[5,6]。为提高大别山冬青在园林绿化中的应用范围及药用生产价值,急需通过其它高效育苗途径提高其繁殖率。组织培养技术可在很大程度上提高繁殖系数,培养体系建立后,通过组培技术可在短时间内获得大批量优质的种苗[7,8],这对丰富我省绿化树种、推动大别山冬青的园林应用及苦丁茶制作有极大的意义。但目前，大别山冬青组培技术鲜有报道。本项目采用大别山冬青当年生嫩枝茎段为外植体进行组培快繁，探索出大别山冬青离体快繁体系,以此技术手段为后期大别山冬青的推广应用及开发提供了有效的试验依据和技术指导，促进了大别山冬青这一优质树种的产业化生产，在生产上具有重要的现实意义。

在植物的组培过程中，选择适宜的培养基对大别山冬青的诱导分化及器官的再生培养有重要作用。因此，以MS、B5、WPM为基本培养基，通过正交试验设计不同的培养基组合，筛选出最适宜大别山冬青腋芽诱导的培养基。试验结果发现，采用WPM培养基作为基本培养基时，腋芽的诱导率较低；采用MS培养基作为基本培养基时，诱导率较高，且其他指标也优于WPM及B5培养基。这与前人在木本植物组织培养中的研究较为一致[9-12]。作为广泛使用的MS培养基，其微量元素齐全，硝态氮和铵态氮含量相对较高，而WPM及B5培养基中铵态氮含量低，硝态氮含量则较高[13]，高比例的铵态氮和硝态氮可能对大别山冬青的诱导分化有一定促进作用。

植物生长调节剂种类、配比及浓度在植物的离体快繁中，也对外植体的诱导分化有很大影响[14]。向培养基中添加不同生长调节剂对外植体的内源激素水平有一定的影响，因此不同浓度生长调节剂及配比的培养基对外植体诱导分化能力产生明显影响[15]。本试验在初代培养中，选择不同的生长调节剂，腋芽萌发情况差异较大。随着NAA质量浓度的升高，大别山冬青腋芽萌发率呈先增高后降低趋势；而随着6-BA质量浓度的增加，腋芽萌发率的变化无明显规律。通过正交试验，结果可得知，以MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.3mg·L-1作为培养基是最适宜腋芽诱导的培养基，其腋芽萌发率高，新稍生长快。可见，在组织培养过程中，植物生长调节剂对促进细胞伸长生长有一定的作用。

试验中，通过观察发现，基部愈伤组织在外植体腋芽萌发时形成。将其处理后进行增殖培养的同时，在原培养基中继续培养原外植体。后期基部产生的愈伤组织，使其继续培养萌发新芽。但5次继代后，基部不再有愈伤组织形成，茎段上也不再有新的腋芽萌发。该现象与冬青茎段的组织培养研究结果一致[16,17]。试验结果表明，外植体基部愈伤组织的形成与腋芽的萌发有一定的关系。在增殖培养过程中，发现6-BA诱导效果优于IBA，在30d内，可使增殖系数高达3.6。但是在继代过程中，发现随着继代次数的增加，部分愈伤组织出现褐化，导致大别山冬青愈伤组织褐化的原因很多，可能与外界的环境条件、培养基种类及状态、生长调节剂种类及类型等有关，具体原因有待于进一步试验研究。

试验结果表明，1/2MS培养基中添加生长调节剂可诱导大别山冬青组培苗生根。吴月燕等[18]研究发现：IBA质量浓度在一定的范围内，IBA质量浓度对內源IAA的含量有影响，并随着IBA质量浓度的增加呈升高趋势[18]；外源NAA则对內源IAA的合成有促进作用，对促进根的形成有一定作用[19]。本试验研究发现，随着NAA质量浓度的增加，生根率逐渐增加。但相同质量浓度NAA条件下，IBA质量浓度过高，生根率反而下降。可见，大别山冬青组培苗生根情况与生长调节剂种类及质量浓度配比有一定的关系。

通过本试验研究，建立了以茎段作为外植体的大别山冬青组培快繁技术体系，得出大别山冬青初代培养最佳培养基为MS培养基，且添加6-BA1.0mg·L-1+NAA0.3mg·L-1是最适宜腋芽诱导的培养基。继代增殖培养则以MS+6-BA1.0mg·L-1+IBA0.3mg·L-1最适宜,增值系数最高。组培苗生根培养基以1/2MS+NAA0.3mg·L-1+IBA0.2mg·L-1最宜，生根率达95%，根系发达。经生根后的试管苗移栽至蛭石(V)：珍珠岩(V)：泥炭土(V)=2:1:2混合基质，控制环境条件，成活率可达85%。本试验研究建立的大别山冬青组培快繁体系，为加快大别山冬青的推广应用奠定了重要的技术基础。