H19基因在骨肉瘤中的表达及其对预后的影响

李勇，高书明，刘广飞，王路，卢守亮，程才

(沧州市中心医院骨一科，河北 沧州 061001)

骨肉瘤是最常见的间质细胞来源的恶性肿瘤之一，其周围血流丰富，早期可发生转移，死亡率较高[1]。虽然手术技术的提高及放化疗的应用逐渐成熟，但是其5年生存率未见明显提高[2]。随着肿瘤基因研究越来越深入，分子靶向治疗已成为近年来研究的热点[3]。既往研究[4]发现骨肉瘤的发生与p14ARF、RB和p16INK4等原位基因激活或基因重组及突变有关。H19基因正常情况下的最终表达产物为RNA，但是当异位H19的ORF6非翻译区发生突变或者删失可能会产生蛋白质，并且可导致细胞的恶变。目前，相关研究[5-6]发现H19基因在多种恶性肿瘤中均为高表达，如膀胱癌、肺癌等。而H19基因与骨肉瘤之间的关系目前研究较少，本研究旨在探讨H19基因在骨肉瘤中的表达及其对预后的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2014年4月至2018年4月沧州市中心医院收治的肉瘤患者81例，所有患者均经病理证实为骨肉瘤，同时选取非肿瘤组织作为配对研究，非肿瘤组织包括癌旁组织(距肿瘤边缘<3 cm)及瘤远旁组织(距肿瘤边缘>5 cm)。所有患者均经放化疗。入选患者中，男性48例，女性33例，年龄14～56岁，平均年龄(24.45±3.21)岁。所有病理标本手术切除后保存于液氮中，用于后期检测，所有入选患者均签署了知情同意书，所有临床病理资料通过翻阅病历收集。

1.2 试剂

PCR反应试剂盒、反转录试剂盒、内切酶Rsa I、Trizol试剂、mRNA Marker I(北京天为时代)。H19及GAPDH的上下游引物(上海生工生物工程技术有限公司合成)见表1。

表1H19及GAPDH的上下游引物

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR (1)RNA提取：组织剪碎后用Trizol提取RNA，并用分光光度仪测纯度及含量(A260/A280大约为1.8～2.0)。(2)RT-PCR：首先采用反转录试剂盒，按照说明书进行emRNA链合成，然后emRNA，按照PCR反应试剂盒说明书进行PCR扩增。扩增条件：95 ℃预变性2 min，94℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72qc延伸30 s，循环30个周期后，最后72 ℃延伸7 min。PCR的参考体系为GAPDH。将H19及β-actin一起上样，2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪分析电泳结果，Dolphin分析软件测定灰度值，样本的灰度值与β-actin的比值作为最终结果。

1.3.2 RFLP检测H19印迹状态 限制性酶切反应体系：主要包括2μL 10×Buffer，10 U。内切酶Rsa I，PCR产物37 ℃水浴酶切过夜，然后做琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相。酶切后若为142 bp、247 bp或105 bp条带，则为单等位基因表达，即正常印迹；若为3条不同的条带(247 bp、105 bp和142 bp)，则为印记基因丢失(loss of imprinting，LOI)。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0分析，计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 H19mRNA在骨肉瘤、癌旁组织及癌旁远组织的表达

将提取的mRNA进行琼脂糖凝胶电泳，显像后如图1所示。H19mRNA在骨肉瘤组织中高表达，在癌旁组织及癌旁远组织中低表达。待测样本中β-actin均有表达，提示标本中总RNA及RT-PCR反应有效。

2.2 RT-PCR-RFLP法检测骨肉瘤中H19 mRNA印迹状态

所有病理标本中，骨肉瘤、癌旁组织及癌旁远组织的H19 mRNA表达率分别为43.2%，14.8%，3.7%，LOI的发生率与不同组织之间有显著相关性(P<0.05)。见图2。

2.3 H19基因与骨肉瘤临床病理资料的关系

81例骨肉瘤患者中，H19基因表达与肺转移，Enneking分期有关，且高表达的骨肉瘤患者2年生存率明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。H19基因表达与性别、年龄、肿瘤大小、部位及病理分型无明显相关(P>0.05)。见表2。

表2H19基因与骨肉瘤临床病理资料的关系(例)

3 讨论

骨肉瘤作为最常见的间质组织恶性肿瘤之一，恶性程度较高，早期易发生肺部转移，预后较差。因此，寻找骨肉瘤发生发展的根源并找出治疗靶点是目前研究治疗骨肉瘤的热点[7]。H19基因定位到人的染色体为11p15.5，基因长度为3 kb，其中主要包括4个内含子和5个外显子。目前，体内尚未发现H19的蛋白表达，故认为其可能不参与翻译，但其mRNA水平可以检测到，因此主要影响翻译水平[8]。目前，研究[9]发现H19基因的突变及丢失率极高，均超过了p53基因。

近年来，研究发现H19基因与肿瘤的发生密切相关。研究[10]发现H19mRNA通过调控肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及血管形成的基因表达，影响肿瘤的发生和发展。目前，已有研究[11]证实H19基因在多种肿瘤中的阳性率高于正常组织，如宫颈癌、肠癌及食管癌等，且其可以作为肝癌和宫颈癌的复发、转移及预后的评估因素之一。作为印迹蛋白，H19致癌的方式是杂合性丢失，或者单亲二倍体，主要表现为同源染色体中两条等为基因丢失或是突变活性导致其中一个抑癌基因的功能拷贝丢失，表达增加，或者是印迹控制中心的突变失去活性，最终导致多个印迹的癌基因表达异常[12]。

本研究指出H19mRNA在骨肉瘤组织中高表达，在癌旁组织及癌旁远组织中低表达，说明癌细胞中H19mRNA呈高表达状态。其原因可能是H19mRNA可以通过多种途径调节染色质重构、DNA甲基化、组蛋白修饰，且H19mRNA作为miRNA的前体，继而从基因水平、转录水平以及蛋白质翻译水平调控机体的功能[13]。此外，LOI的发生率与不同组织之间有显著相关性(P<0.05)。其原因可能是H19 基因可转录出一种长链非编码 RNA H19，可以调节染色质重构、 DNA 甲基化，也可作为 miRNA 的前体，在细胞内对组蛋白进行修饰，继而从基因水平、转录水平以及蛋白质翻译水平调控机体的功能。而不同组织中，H19基因与其产物miRNA呈现的表达水平不同，导致其LOI的发生率出现差异[14]。骨肉瘤患者中，H19基因表达与肺转移、Enneking分期有关，且高表达的骨肉瘤患者2年生存率明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。这提示H19基因在转录及转录后水平，其过表达与靶基因的状态、细胞的类型、细胞的发育阶段及临床病理分级、激素及淋巴结转移有关，这与王彩霞等[15]研究结果相似。

综上所述，H19基因在骨肉瘤中高表达，且与肺转移、Enneking分期有关，H19基因高表达的患者预后差，H19基因可作为判断骨肉瘤预后的指标之一。