扶正祛积汤联合埃克替尼对肺癌移植瘤Fas、Bax和CyclinD1表达的影响*

赵同伟 潘智敏 袁国荣 卢丽琴 谷建钟 洪誉鹏 苏 丹 周红英 洪朝金 钦志泉#

1 浙江省人民医院 浙江 杭州 310014

2 杭州医学院附属人民医院 浙江 杭州 310014

3 浙江省中医院 浙江 杭州 310006

本研究利用人肺腺癌A549细胞（EGFR野生型）构建裸鼠移植瘤模型，验方“扶正祛积汤”联合埃克替尼干预后，研究中西医结合治疗的协同抑瘤作用并探讨对移植瘤Fas、Bax和CyclinD1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料：分述如下。

1.1.1 实验材料：扶正祛积汤来自于潘智敏教授临床经验方；埃克替尼自购自浙江贝达药业有限公司（产品批号：20161207）。

1.1.2 实验动物：20只BLAB/c裸鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司[（许可证号：SCXK（苏）2016-0010］，均雄性，6～8周龄，重量16～24g。

1.1.3 实验试剂：Fas抗体（affinity Biosciences）、Bax抗体（affinityBiosciences）、CyclinD1抗体（Cell Signaling Technology）、WB相关试剂（江苏凯基生物技术股份有限公司）、DAB显色试剂盒（碧云天生物技术公司）。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 扶正祛积汤组成及制备：全方由南沙参、北沙参、太子参、莪术、猫爪草、鱼腥草等15味草药组成。在浙江省立同德医院中西医结合肿瘤研究所煎制和抽提，经分装灭菌，4℃冰箱保存备用。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型的建立及分组灌胃：每只裸鼠腋下接种1×106个细胞，接种后14天，皮下移植瘤形成。将成瘤的裸鼠随机分为4组，每组5只，分笼饲养，按分组灌胃，分别为模型组（生理盐水）、扶正祛积汤组（原液浓度50%）、埃克替尼组（50mg/Kg/d）、扶正祛积汤联合埃克替尼组（两药剂量同单药组），每组均灌胃200μl，1次/天，共21天，末次给药24h脱颈处死裸鼠，取出移植瘤进行后续实验。

1.2.3 肿瘤体积、抑瘤率和增效率的测定：灌胃前1天，灌胃第6、11、16和21天，测量移植瘤的最大长径（a）和横径（b），再根据公式[体积=1/2×ab2；抑瘤率=（C-T）/C×100%，C为模型组移植瘤的平均体积，T为处理组移植瘤的平均体积］计算出各组抑瘤率和联合组增效率。联合组扶正祛积汤增效率(%)Q=(联合组抑瘤率+埃克替尼组抑瘤率)/(埃克替尼组抑瘤率+联合组抑瘤率-埃克替尼组抑瘤率×联合组抑瘤率)×100%；结果判定：Q＞1为增效，Q=1为相加，Q＜1为无效。

1.2.4 免疫组化法检测Fas、Bax的表达：免疫组化采用SP法，参照SP法常规步骤操作。结果判断：Fas定位于细胞膜，Bax定位于胞浆，分别以胞膜、胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞。采用双盲法，观察切片至少5个具有代表性的高倍视野，拍摄照片，使用Image-Pro Plus 6.0对免疫组化结果进行评估，得到每个样本平均光密度值（MOD），计算每组标本的平均MOD值，代表该组移植瘤该蛋白的相对表达量。

1.2.5 Western Blot法检测CyclinD1的表达：取各样本肿瘤组织，分别制成细胞匀浆，进行检测。根据蛋白提取试剂盒说明书操作提取细胞总蛋白。按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行蛋白定量。经12%SDS-PAGE电泳后转膜。脱脂奶粉封闭，CyclinD1一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1h，ECL孵育3～5min。暗室中用X胶片感光、显影、定影。采用GAPDH蛋白表达作为内参照，采用Image J扫描软件扫描WB条带得到CyclinD1灰度值，该灰度值和GAPDH的灰度值的比值即为CyclinD1表达的相对值。

2 实验结果

2.1 扶正祛积汤对埃克替尼抑制肺癌A549细胞裸鼠移植瘤的影响：灌胃第21天埃克替尼组与扶正祛积汤组抑瘤率之和＜联合组抑瘤率，联合组增效率=111.11%，增效率＞1，说明扶正祛积汤对埃克替尼有增效的作用，扶正祛积汤联合埃克替尼后能协同增效抑制移植瘤生长。见表1。

表1 各组裸鼠移植瘤抑瘤率变化（%，n=20）

2.2 扶正祛积汤联合埃克替尼对肺裸鼠移植瘤Fas、Bax表达的影响：各组裸鼠移植瘤指标免疫组化MOD值见表2。Fas组化染色结果见图1，蛋白定位细胞膜，在细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞。联合组瘤组织Fas蛋白的MOD明显高于埃克替尼组、扶正祛积汤组和模型组（P＜0.05）。Bax组化染色结果见图2，蛋白定位于细胞浆，在细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞。联合组瘤组织Bax蛋白的MOD要明显高于埃克替尼组、扶正祛积汤组和模型组（均P＜0.05）。

表2 各组裸鼠移植瘤Fas和Bax蛋白MOD值（±s，n=20）

表2 各组裸鼠移植瘤Fas和Bax蛋白MOD值（±s，n=20）

注：与联合组比较，*P＜0.05。

组别模型组埃克替尼组扶正祛积汤组联合组Bax 264875.14±106540.22*355662.01±193885.64*338772.29±165312.96*45632.26±24039.97 Fas 29510.90± 8443.14*412833.80±136696.20*42273.35±23462.76*472656.87±149156.91

模型组 埃克替尼组 扶正祛积汤组

图1 各组裸鼠移植瘤组织Fas染色（SP法，200倍）

模型组 埃克替尼组 扶正祛积汤组

图2 各组裸鼠移植瘤组织Bax染色（SP法，200倍）

2.3 扶正祛积汤联合埃克替尼对肺移植瘤cyclinD1表达的影响：各组移植瘤组织cyclinD1蛋白表达见图3。模型组、埃克替尼组、扶正祛积汤组和联合组的CyclinD1蛋白表达相对值（CyclinD1/GAPHD）分别为0.39±0.10、0.30±0.093、0.32±0.13和 0.22±0.064。联合组cyclin D1表达水平明显低于埃克替尼组（P＜0.05）、扶正祛积汤组（P＜0.05）和模型组（P＜0.01）。

图3 各组裸鼠移植瘤cyclinD1蛋白表达

3 讨论

进展期NSCLC多为气阴两虚，邪积多为痰、瘀、热毒，扶正祛积汤治疗以益气养阴、化痰祛瘀为主，药用南沙参、北沙参、太子参、麦冬、天冬、鲜石斛益气养阴，制半夏、浙贝、米仁、莱菔子、莪术化痰祛瘀，猫爪草、黄芩、鱼腥草、野荞麦根清热解毒，全方攻补兼施，祛邪不伤正，补虚不留邪。本实验结果显示，联合组增效率为111.11%，说明扶正祛积汤联合埃克替尼对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤的抑瘤效果明显强于埃克替尼组。联合组Fas的表达明显高于埃克替尼组（P＜0.05），可以明显抑制移植瘤的增殖，说明扶正祛积汤可以进一步提高埃克替尼引起的Fas的表达水平而增加抑瘤效果。联合组瘤组织Bax表达水平要明显高于埃克替尼组（P＜0.05），提示扶正祛积汤可以进一步提高埃克替尼引起的Bax的表达水平，这可能和两者协同抑制移植瘤的增殖有关。联合组移植瘤组织cyclin D1的表达水平显著低于埃克替尼组（P＜0.05），提示扶正祛积汤可以进一步降低埃克替尼引起的cyclinD1的表达下降，协同埃克替尼抑制肿瘤细胞的分裂增殖。

综上，扶正祛积汤可以提高埃克替尼对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用，扶正祛积汤的协同增效抑瘤机制可能和提高Fas、Bax表达水平和降低CyclinD1的表达水平有关。当然，本研究还存在不足，例如未能深入研究扶正祛积汤联合埃克替尼抑制肺癌细胞增殖的信号通路机制，Fas和Bax使用了免疫组化未使用半定量的Western blot等，未检测细胞周期分布和细胞凋亡等，这些均有待于进一步研究和完善。