不同提取方法对三叶青乙醇浸提物含量及肺癌细胞A549增殖抑制的影响*

李礼斌 杨 絮 胡轶娟 童晔玲 刘培刚#

1 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

2 浙江省立同德医院 浙江 杭州 310012

三叶青属于葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤，是我国一种珍稀的药用植物，以块根或者全草入药，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功效[1］。其抗肿瘤活性的发现促进了三叶青在肿瘤临床治疗上的应用及其相关分子机理研究的开展[2］。三叶青在我国长江以南地区分布，其中浙江省和广西壮族自治区是其两个主要产地，且两地的三叶青在性状和药效方面存在一定的差异[3］。有关三叶青活性物质在不同提取方法、不同产地的活性物质浸出差异及抗肿瘤活性研究报道相对较少。因此，本研究就不同提取方法对不同产地三叶青乙醇浸提物与黄酮类活性成分含量及抗肺癌细胞A549增殖活性等影响展开研究，以期为三叶青等中药材活性成分提取、制剂工艺及临床应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料：2种三叶青样品（块茎）分别采自浙江省温岭市和广西壮族自治区天峨县，经浙江省中医药研究院药用资源研究中心浦锦宝研究员鉴定，分别为两产地的葡萄科植物三叶青T.hemsleyanum块茎，样本存放于浙江省中医药研究院药用资源研究中心药用植物标本室。

1.2 药材提取工艺：两产地新鲜三叶青块茎洗净晾干后经切片机切片，一部分保留，用作鲜切片浸提，另外样本在45℃条件下烘干留作加热回流与干切片常温浸提用。加热回流法：各取浙江产和广西产三叶青干切片30g，按照1∶20比例加入600ml 75%的乙醇，80℃条件下提取1.5h，提取2次后合并提取液，并定容到1200ml。常温浸提法：①干切片：各取浙江产和广西产三叶青干切片30g，按照1∶20比例加入600ml 75%的乙醇，常温条件下提取10d，提取2次，最后合并提取液体并定容到1200ml。②鲜切片：按照每8g鲜切片获取1g干切片的比例，各取浙江产和广西产三叶青干切片240g，按照1∶20比例加入600ml 75%的乙醇，常温条件下提取10d，常温条件下提取10d，提取2次，最后合并提取液体并定容到1200ml。

1.3 不同工艺下三叶青乙醇浸提物及总黄酮含量测定：将蒸发皿洗干净，放在105℃+2℃的烘箱中烘3h，放在干燥器内冷却后称量，反复烘干，冷却，称量，直至恒重（两次称量的重量差不超过0.5mg），放在干燥器内备用。各取上述样本200ml，置于备用培养皿中，置于水浴锅上挥干后放在105℃+2℃的烘箱中烘3h，放在干燥器内冷却后称量，然后计算三叶青乙醇浸提物含量。采用紫外分光光度法，参照文献[4］测定方法与流程进行上述三叶青各处理样本总黄酮浸出的含量测定。

1.4 UPLC指纹图谱分析：采用UPLC技术对上述不同工艺下三叶青乙醇浸提液指纹图谱进行检测。色谱条件为：ACQUITYTMBETC18色谱柱（2.1mm×100mm，1.7μm），DAD检测器；流动相为乙腈（A）-100%甲醇）（B），流速0.2ml·min-1，柱温30℃，进样量2μl，洗脱0～10min，甲醇5%～100%，10～12min，甲醇100%。

1.5 肿瘤细胞抑制实验：肿瘤细胞抑制实验开始前，先将上述各样本在水浴（60℃）挥干，然后加1ml RPMI-1640培养基溶解，配置成3g（生药）/ml的样本备用，用时用培养基稀释至所需浓度。取对数生长期A549细胞用0.25%的胰蛋白酶进行消化后，以5000个/孔的密度接种于96孔培养板，培养24h后，分别加入不同浓度[（31.25μg（生药）/ml）～1000μg（生药）/ml］的上述含各三叶青提取物溶液100μl，共6个梯度，对照组加培养液，每种浓度重复3孔，重复3次，另设1个空白对照孔，处理48h后采用CKK-8法测定细胞活性。

2 结果

2.1 不同处理工艺两产地三叶青乙醇浸提物含量比较：具体数据见表1。结果显示：鲜切片常温浸提法获得乙醇浸提物含量较其他2种提取工艺要高，但是浸提物中所含黄酮比率最低；加热回流提取下，浙江产三叶青乙醇浸提物及黄酮含量均高于广西产三叶青；常温浸提工艺下，广西产三叶青乙醇浸提物含量均高于浙江产三叶青；干切片不管是加热回流法还是常温浸提法，浙江产三叶青黄酮浸出量均高于广西产三叶青。3种工艺下，浙江产三叶青黄酮浸出量占乙醇浸提物量比率均高于广西产三叶青。

表1 不同处理工艺两产地三叶青黄酮类物质含量

2.2 不同处理工艺三叶青乙醇浸提物指纹图谱：采用UPLC法对两大产地三叶青在不同提取方法下进行了指纹图谱研究分析（见图1）。结果表明，加热回流法工艺下，两产地三叶青所浸出的乙醇浸提物化学成分在种类上差异性较小，而常温浸提工艺下，不管是干切片还是鲜切片，两产地三叶青所浸出的乙醇浸提物化学成分在种类上均存在明显的差异。同一品种间，不同处理工艺间三叶青所浸出的乙醇浸提物化学成分在种类上均存在明显差异，推测可能是由于温度影响到了一些活性成分的稳定性和鲜品中一些活性物质浸出较慢等。

图1 两产地不同提取工艺三叶青乙醇浸提物指纹图谱

2.3 不同处理工艺三叶青乙醇浸提物肿瘤抑制效果比较：图2显示，两产地不同处理三叶青乙醇浸提物处理48h对肺癌细胞A549的增殖抑制效果存在一定的差异，但是都呈现剂量依赖性。不管何种处理，浙江产三叶青乙醇浸提物在同一浓度下对于肺癌细胞A549的增殖抑制效果要优于广西产三叶青，特别是干切片常温浸提工艺下。同一品种不同处理间肿瘤抑制效果存在一定的差异，其中，浙江产三叶青干切片常温浸提抑制效果最好，而广西产三叶青干切片常温浸提抑制效果最差。

图2 两产地不同处理三叶青黄酮类物质肿瘤抑制效果

3 讨论

研究显示，三叶青可以通过多途径、多靶点协同发挥抗肿瘤作用，其中三叶青黄酮是一类重要的抗肿瘤活性成分，在三叶青中含量占到了2%～9%[5-6］。中药材药效与活性物质含量及组成存在密切的关系，而提取方法的不同又将会影响到中药材活性物质的浸出及组成[7］。本研究结果显示：不同的提取工艺对于三叶青黄酮类物质的浸出具有一定的影响；这也是不同处理工艺下三叶青药效存在一定差异的原因，三叶青中发挥主效肿瘤抑制效果的活性物质的浸出率影响了抑制效果；不同产地三叶青肿瘤抑制效果差异跟不同品种间乙醇浸提物含量及黄酮含量差异不存在相关性，可推测肿瘤抑制效果可能跟浸提物种主要药效活性物质含量差异相关，而三叶青中主要药效活性物质也将有待进一步进行分析。因此，在肿瘤等疾病的防治上，选择优质的道地性药材及合适炮制工艺对于疗效显得至关重要。本研究结果将会为三叶青的临床应用选择和炮制工艺选择提供一定的数据支持。