血管生成拟态及骨桥蛋白和基质金属蛋白酶2在三阴性乳腺癌组织中的表达及意义

刘 明，郭 满，张 浩，李伟汉，张子杰

(1.新乡医学院研究生处，河南 新乡 453003；2.南阳市中心医院乳腺外科，河南 南阳 473000；3.南阳市中心医院病理科，河南 南阳 473000)

乳腺癌是我国女性常见的恶性肿瘤之一，发病率居女性恶性肿瘤首位，且逐年增长并趋于年轻化[1-4]。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是雌、孕激素受体和人类表皮生长因子受体-2均不表达的乳腺癌亚型，其恶性程度高，预后差，复发转移率高，病死率高[5]。MANIOTIS等[6]发现了一种不需要内皮细胞参与而生成的肿瘤血管，被称为血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)，是多种实体恶性肿瘤的重要供血途径[6-7]。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种分泌性钙结合糖磷酸化蛋白，在骨组织矿化、细胞黏附、信号转导、细胞免疫和血管再塑等方面具有多种生物功能，是一种多功能肿瘤调节蛋白[8]。研究显示，OPN 下调对TNBC细胞自噬、凋亡活性有促进作用[2]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)-2是MMP中非常重要的一员，活化的MMP-2定位于细胞穿透基质的突出部位，其在酶解细胞基质中的作用尤为突出，几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶[9]。目前，关于VM、OPN及MMP-2在TNBC组织中的表达、相互作用及与TNBC临床病理特征关系的研究尚少。本研究通过观察VM、OPN及MMP-2在TNBC组织中的表达情况，分析三者在TNBC组织中表达的临床意义及相关性，探讨其与TNBC发生、发展的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2012年1月至2015年12月南阳市中心医院收治的120例首次经病理检查确诊的女性TNBC患者的癌组织标本为观察对象，患者年龄28～76(51.86±9.11)岁，病历资料及石蜡标本完整，住院前均未行任何相关治疗。另收集同期30例因良性乳腺增生行手术切除的组织标本作为对照组，患者年龄18～60(40.77±10.90)岁。2组患者的年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2主要试剂与仪器兔抗人MMP-2多克隆抗体、兔抗人OPN单克隆抗体及抗体稀释液购自北京中杉生物技术有限公司，过碘酸-希夫(periodic acid-Schiff stain，PAS)反应液套组购自北京博奥森生物技术有限公司，鼠抗人血小板-内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31)单克隆抗体及二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)试剂盒(包括内源性过氧化物酶封闭液、酶标羊抗鼠/兔聚合物、20倍DAB浓缩底物及底物缓冲液)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)、枸橼酸盐缓冲液(抗原修复液，pH=6.0)购自郑州赛诺特生物技术有限公司，中性树胶购自上海沪试实验室器材股份有限公司；2235型石蜡切片机购自德国徕卡公司，PHY-3型摊片烤片机购自中威北化科技有限公司，DHG-9030A型恒温鼓风干燥箱购自东莞市科迪仪器有限公司，4 ℃低温冰箱购自青岛海尔集团，bx-35型光学显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.3CD31及PAS双重染色法检测TNBC及良性乳腺增生组织中VM的表达2组标本均行连续 3 μm 石蜡切片，60 ℃恒温箱烤片2 h，二甲苯、梯度乙醇脱蜡复水，抗原修复，自然冷却至室温，三蒸水冲洗1 min，过氧化物酶封闭液室温孵育30 min，PBS冲洗3次，正常山羊血清封闭液室温孵育 20 min，PBS冲洗3次，除去PBS后分别加入一抗(鼠抗人CD31单克隆抗体)4 ℃过夜；PBS冲洗3次；滴加二抗(酶标羊抗鼠/兔聚合物)室温孵育 30 min，PBS冲洗3次，DAB显色，于光学显微镜下控制显色时间，待血管内皮细胞着色后，终止染色；将切片置于过碘酸溶液中反应10 min；蒸馏水冲洗，甩去多余水分，置于希夫液中，避光反应15 min；蒸馏水冲洗3次；苏木精复染细胞核，流水冲洗，盐酸乙醇分化，蒸馏水冲洗返蓝；梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察有无VM。VM的典型表现为由肿瘤细胞模仿机体血管生成而形成的樱桃红色管道，内壁无血管内皮细胞衬附，管道中有红细胞，周围无明显坏死及炎细胞浸润。存在VM者判定为阳性，无VM者判定为阴性。

1.4免疫组织化学染色检测TNBC及良性乳腺增生组织中OPN、MMP-2的表达2组标本均行连续3 μm石蜡切片，60 ℃恒温箱烤片2 h，二甲苯、梯度乙醇脱蜡复水，抗原修复，自然冷却至室温，三蒸水冲洗1 min，过氧化物酶封闭液室温孵育30 min，PBS冲洗3次，正常山羊血清封闭液室温孵育 20 min，PBS冲洗3次，加入一抗兔抗人MMP-2多克隆抗体或兔抗人OPN单克隆抗体4 ℃过夜；PBS冲洗3次；滴加二抗酶标羊抗鼠/兔聚合物室温孵育30 min，PBS冲洗3次；DAB室温显色5 min，三蒸水冲洗1 min，苏木精复染 5 min，梯度乙醇脱水、透明，中性树胶封片，显微镜观察着色情况。OPN、MMP-2以细胞质中出现棕色或棕黄色颗粒为阳性细胞。按半定量积分法判断OPN、MMP-2表达情况，根据染色强度及阳性细胞所占比例计分，染色强度：未着色为0分，浅黄色为1分，深黄色为2分，深棕色为3分；阳性细胞百分率：在显微镜低倍镜下选取典型的着色区域，高倍镜下随机选取10个视野，计算其平均阳性细胞百分率，平均阳性细胞百分率≤5% 为0分，6%～25%为1分，26%～49%为2分，≥50%为3分；2项评分相加，0～1分为阴性(-)，2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)， 5～6分为强阳性(+++)，(+)～(+++)均为阳性。

2 结果

2.1TNBC及良性乳腺增生组织中VM表达比较TNBC组织中VM阳性表达32例(26.7%)，良性乳腺增生组织中VM阳性表达0例(0.0%)。TNBC组织中VM阳性表达率明显高于良性乳腺增生组织，差异有统计学意义(χ2=10.169，P<0.05)。见图1。

A：TNBC组织；B：良性乳腺增生组织；箭头示VM。

图1TNBC及良性乳腺增生组织中VM的表达(CD31、PAS染色，×400)

Fig.1ExpressionofVMinTNBCtissuesandbenignhyperplasiatissues(CD31andPASstaining，×400)

2.2TNBC及良性乳腺增生组织中OPN、MMP-2表达比较TNBC组织中OPN、MMP-2阳性表达分别为30例(25.0%)、86例(71.7%)。良性乳腺增生组织中OPN、MMP-2阳性表达分别为1例(3.3%)、5例(16.7%)。TNBC组织中OPN、MMP-2的阳性表达率显著高于良性乳腺增生组织，差异有统计学意义(χ2=6.872，30.425，P<0.05)。见图2。

A：TNBC组织中OPN表达；B：良性乳腺增生组织OPN表达；C：TNBC组织中MMP-2表达；D：良性乳腺增生组织MMP-2表达。

图2TNBC及良性乳腺增生组织中OPN和MMP-2的表达(免疫组织化学染色，×200)

Fig.2ExpressionofOPNandMMP-2inTNBCtissuesandbenignhyperplasiatissues(immunohistostaining，×200)

2.3VM、OPN及MMP-2的表达与TNBC临床病理特征的关系结果见表1。VM、OPN及MMP-2在TNBC组织中的表达与肿瘤大小、淋巴结转移情况和临床分期有关(P<0.05)，与患者年龄、绝经状态及家族史无关(P>0.05)。

表1VM、OPN、MMP-2的表达与TNBC临床病理特征的关系

Tab.1RelationshipbetweentheexpressionofVM，OPNandMMP-2andtheclinicopathologicalfeaturesofTNBC

临床病理特征nVM+/例(%)-/例(%)χ2POPN+/例(%)-/例(%)χ2PMMP-2+/例(%)-/例(%)χ2P年龄 ≤35岁20(0.0)2(100.0)0.7400.3900(0.0)2(100.0)0.6780.410 2(100.0)0(0.0)0.8040.370 >35岁11832(27.1)86(72.9)30(25.4)88(74.6)84(71.2)34(28.8)肿瘤大小 T1493(6.1)46(93.9)2(4.1)47(95.9)23(46.9)26(53.1) T26827(39.7)41(60.3)18.9420.00026(38.2)42(61.8)20.5660.00061(89.7)7(10.3)25.6900.000 T332(66.7)1(33.3)2(66.7)1(33.3)2(66.7)1(33.3)淋巴结转移 N0+N1 9610(10.4)86(89.6)68.8150.0007(7.3)89(92.7)80.2780.00064(66.7)32(33.3)5.9100.015 N2+N3 2422(91.7)2(8.3)23(95.8)1(4.2)22(91.7)2(8.3)临床分期 I312(6.4)29(93.5)1(3.2)30(96.8)16(51.6)15(48.4) II6512(18.5)53(81.5)37.3860.00011(16.9)54(83.1)42.1000.00051(78.5)14(21.5)8.2820.016 III2418(75.0)6(25.0)18(75.0)6(25.0)19(79.2)5(20.8)绝经状态 是6618(27.3)48(72.7)0.0280.86816(24.2)50(75.7)0.0450.83246(69.7)20(30.3)25.6900.000 否5414(25.9)40(74.1)14(25.9)40(74.1)40(74.1)14(25.9) 家族史 有3210(31.2)22(68.7)0.4690.49411(34.3)21(65.6)2.0450.15323(71.9)9(28.1)0.0010.976 无8822(25.0)66(75.0)19(21.6)69(78.4)63(71.6)25(28.4)

2.4VM、OPN及MMP-2在TNBC组织中表达的相关性结果见表2。TNBC组织中VM与OPN、MMP-2表达呈正相关(r=0.609、0.296，P<0.05)，OPN与MMP-2表达呈正相关(r=0.192，P<0.05)。

表2VM、OPN及MMP-2在TNBC组织中表达的相关性

Tab.2CorrelationoftheexpressionofVM，OPNandMMP-2inbreastcancertissues

免疫组织化学指标VM+/例-/例rPOPN+/例-/例rP MMP-2 +30560.2960.00126 600.1920.035 -2324 30OPN +22 80.6090.000 -1080

3 讨论

乳腺癌是危害女性生命健康的常见肿瘤，近年来发病率不断上升[10-12]。而TNBC是一种特殊类型的乳腺癌，占所有乳腺癌的15%～20%[13]。TNBC的侵袭性强，复发率高，治疗方法有限，故预后较差[5]。VM是恶性肿瘤的一种重要的供血方式，为肿瘤细胞的生长提供更为充足的血液来源。XING等[14]研究表明，VM的表达与乳腺癌患者的生存率相关，VM阳性是乳腺癌的独立生存危险因素。黄小环等[15]研究显示，VM在乳腺癌组织中的表达与肿瘤大小、病理分期、淋巴结转移有密切联系。本研究采用CD31与PAS双重染色技术，同样检测到TNBC组织中存在VM，且VM阳性表达率与肿瘤大小、淋巴结转移情况及临床分期有关，而与患者年龄、绝经状态及家族史无关。

OPN作为一种多功能蛋白，在决定各种肿瘤的致癌潜能方面起着至关重要的作用，尤其在高侵袭性肿瘤中广泛表达。本课题组前期研究发现，下调OPN的表达可以通过多种通路促进乳腺癌细胞的自噬和凋亡活性，从而抑制癌细胞的生长和转移[2，16]，说明OPN在乳腺癌组织的增殖转移过程中有重要作用。为进一步探讨OPN在乳腺癌组织侵袭中的作用是否与血管生成有关，本研究分析了TNBC组织中OPN表达及其与VM的关系，结果显示，OPN在TNBC组织中高表达，并且与VM的表达呈正相关，说明OPN可能通过多种机制影响乳腺癌肿瘤血管的生成，从而增加肿瘤的侵袭性。

MMP-2为基质金属蛋白酶的重要成员，活化的MMP-2定位于细胞穿透基质的突出部位，其在酶解细胞基质的作用中尤为突出[9]。近年来，相关研究证实，MMP-2在肿瘤侵袭转移中起关键性作用。LI等[17]通过实时荧光反转录聚合酶链反应和免疫印迹法检测2个乳腺癌细胞株(MDA-MB-231和MCF-7)和1个人正常乳腺细胞系(HS578Bst)中MMP-2的表达水平，结果显示，MDA-MB-231和MCF-7细胞中MMP-2 mRNA和蛋白表达水平显著高于HS578Bst细胞；同时免疫组织化学染色检查乳腺癌患者组织标本中MMP-2的表达，结果显示，在乳腺癌组织中 MMP-2 表达水平与淋巴结转移、肿瘤分期相关。这与本研究结果一致，表明MMP-2在TNBC的侵袭转移过程中起重要作用。

本研究相关性分析结果显示，TNBC组织中VM与OPN、MMP-2表达呈正相关，OPN与MMP-2表达呈正相关，这与KANG等[18]对肝癌的研究结果一致，说明三者在恶性肿瘤的发生、发展及侵袭转移过程中紧密联系。

综上所述，VM、OPN及MMP-2在TNBC组织中高表达，并在其发生、发展及侵袭转移过程中起协同作用。同时检测三者表达情况有助于判断TNBC的增殖转移特征，对TNBC的治疗及预后判断提供一定的理论依据。