温度、添加浓度和微生物对噻虫胺在稻田土壤中降解的影响

张怡宁，殷 丽

(1．上海市崇明区环境监测站，上海 200085；2．上海市浦东新区环境监测站，上海 202150)

1 试验材料

1.1 试验地概况与作物品种

试验在上海市崇明区东平镇农田展开。崇明区东平镇隶属于上海市，位于长江入海口，全区地势平坦，属典型海洋性气候，年平均气温16.8 ℃，年平均降雨量1025 mL，土壤肥力中等偏上，地势平整，灌溉条件良好，该农田的水肥管理和其他栽培条件基本一致。试验地水稻品种为银香18。

1.2 试验药剂

(1)农药标准物质。99.9%噻虫胺原药 clothianidin，上海凯试科技有限公司，

(2)农药制剂。20% 噻虫胺SC(30-50 mL/667 m2)， 河北威远生物化工股份有限公司

1.3 试剂与仪器

1.3.1 供试试剂

实验过程中所使用的试剂目录见表1。

表1 试剂目录

1.3.2 供试仪器

Waters 600E高效液相色谱仪(美国 Waters)；色谱柱Diamonsil-C18，(150 mm×4.6 mm，5 μm)，Waters 2487紫外检测器；岛津GC2010气相色谱仪(日本岛津)，石英毛细管柱hp-5，30 m×0.32 i.d.mm×0.25 μm，带FID检测器；AL104分析天平(瑞士梅特勒公司)；DFT-250手提式高速中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；JLGJ4.5检验砻谷机(浙江台州市粮仪厂)；SHZ-82恒温振荡器(常州澳华仪器有限公司)；RE-52A型旋转浓缩蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)； HS10260D超声波清洗机(天津恒奥科技发展有限公司)；玻璃层析柱(长30 cm、直径1.2 cm)；量筒；移液管；滴管；容量瓶；三角瓶；抽滤瓶；布氏漏斗；分液漏斗；玻璃棒等常用实验仪器。

2 试验方法

2.1 土壤样品采集

采用农业行业标准NY/T 1126.1-2006：土壤样品的采集、处理和贮存。

2.2 试验设计

2.2.1 温度对农药降解的影响

称取100 g空白植稻土壤(精确到0.01 g)放入250 mL锥形瓶中，按推荐剂量加入农药，然后加入无菌蒸馏水将土壤淹没，并保持2～3 cm的水层，混匀后将所有土样分别放入15 ℃ 、20 ℃ 、25 ℃ 、30 ℃ 和35 ℃ 恒温(± 0.5 ℃)培养箱内黑暗培养。

2.2.2 添加浓度对农药降解的影响

称取100 g空白植稻土壤(精确到0.01 g)放入250 mL锥形瓶中，按推荐剂量的0.5倍、1.0倍、1.5倍、2.0倍和2.5倍加入农药，然后加入无菌蒸馏水将土壤淹没，并保持2～3 cm的水层，混匀后将所有土样放入25 ℃恒温(± 0.5 ℃)培养箱内黑暗培养。

2.2.3 土壤微生物对农药降解的影响

称取两组空白植稻土壤各100 g(精确到0.01 g)，放入250 mL锥形瓶中，其中一组用高压湿热法灭菌2次(每次60 min，120 ℃)，然后两组均按推荐剂量加入农药，再加入无菌蒸馏水将土壤淹没，并保持2～3 cm的水层，混匀后将所有土样放入25 ℃恒温(± 0.5 ℃)培养箱内黑暗培养。

以上每个处理均重复3次，培养后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d和28 d分别取样测定农药的残留量。另外每3 d观察一次各处理的水层位置，水少的加水补充，以保持水层位置不变。

农药推荐剂量：噻虫胺为120 mg/kg。

2.3 土壤样品中噻虫胺的提取

称取10.0 g土样，放入250 mL三角瓶中，加入100 mL丙酮，于25 ℃下恒温振荡0.5 h，高速离心分离，将上清液过滤至三角瓶中，用旋转蒸发器(水浴温度30 ℃)蒸干丙酮，将剩余溶液倒入250 mL分液漏斗中，加入30 mL乙酸乙酯，振荡萃取，用旋转蒸发器(水浴温度30 ℃)浓缩至近干，氮气吹干，用甲醇定容至5 mL，过0.45 μm有机滤膜，待高效液相色谱测定。

2.4 检测条件

色谱柱：Diamonsil-C18，(150 mm×4.6 mm，5 μm)；检测器：Waters 2487紫外检测器；流动相：甲醇∶水=3∶7(V/V)；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：266 nm；进样量：5 μL；保留时间：21.4 min；外标峰面积法定量。

2.5 检测分析方法验证

2.5.1 色谱图与标准曲线

称取0.1000 g(精确至0.0002 g)噻虫胺农药标准品，用甲醇有机溶剂定容至100 mL，即配制成1000 mg/L的标准样品母液，然后用甲醇稀释成一定梯度的系列浓度标准液，在相应的色谱条件下检测。检测完成后，以标准溶液浓度(mg/L)为横坐标，检测到的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算标准曲线方程及相关系数。

2.5.2 最低检出量

标样配制与工作曲线最低检出浓度，即方法的灵敏度在实验色谱条件下，以产生3倍噪声时的最小进样量计算。

最低检出浓度(%)=

2.5.3 方法的准确度和精密度

在10.0 g空白土壤样品中分别添加0.1、0.5、1.0 mg/kg的农药标准品，每个浓度3个重复，按各自方法对样品进行提取、净化、检测。方法的准确度以全过程标准添加回收率来衡量，方法的精密度以测定结果的相对标准偏差来衡量。

添加回收率(%)=

2.6 残留量计算

根据所测峰面积，采用外标峰面积法计算样本中的农药残留量Ax。

计算公式如下：

式中：C为农药标准品浓度(mg/L)；S1为农药标准品峰面积；S2为样本峰面积；V为定容体积(mL)；V1为农药标准品进样体积(μL)；V2为样本进样体积(μL)；G为样本量(g)。

3 结果与分析

3.1 标准曲线的绘制和检出限

用色谱纯甲醇把噻虫胺标准母液1000 mg/kg稀释成0.05、0.50、1.00、5.00、10.00 mg/L等5个浓度。在上述色谱条件下，进样5 μL，色谱图见图1。以色谱峰面积为纵坐标、进样浓度为横坐标作图，得到噻虫胺的标准曲线(图2)，其直线回归方程为：y=14008x+14249，相关系数为0.9919，保留时间约为21.4 min，噻虫胺标准品在0.05～10.00 mg/kg范围内与峰面积呈良好的线性关系。按上述仪器条件的3倍噪音计算噻虫胺有效成分的最低检出浓度：土壤为0.003 mg/kg、稻秆为0.004 mg/kg、谷壳为0.006 mg/kg、糙米为0.009 mg/kg，最低检出量为1.5×10-11g。因此，在后续工作中采用此检测方法进行样品分析。

图1 噻虫胺标准品色谱

图2 噻虫胺线性关系

3.2 检测方法的准确度和精密度

噻虫胺在土壤中的平均添加回收率为90.3%～96.5%，标准偏差为2.06%～3.44%，相对标准偏差为2.13%～3.81%(表2)；基本符合农药残留分析的技术要求(樊德方，1982)。

3.3 温度对噻虫胺降解的影响

在不同温度条件下，噻虫胺的残留量随时间的变化趋势均符合一级动力学方程(表3)，当温度由15 ℃升至30 ℃时，噻虫胺的半衰期从20.17 d缩短至9.73 d，但当温度由30 ℃升至35 ℃时，其半衰期9.73 d升至10.89 d。这可能是由于温度的升高使土壤中有机物粘度降低，提高了生物利用率，但更主要的原因可能是：随着外界环境温度逐渐接近于降解噻虫胺的微生物的最适温度(30 ℃左右)，微生物体内各种酶的活性不断增强，加快了微生物的代谢活动，从而加速了噻虫胺的降解。

表2 噻虫胺在土壤中的添加回收率结果

表3 噻虫胺在不同温度土壤中降解的动力学参数

3.4 添加浓度对噻虫胺降解的影响

0.1～2.0倍推荐剂量的噻虫胺在土壤中的的残留量随时间的变化趋势均符合一级动力学方程(表4)，随着添加浓度的升高，噻虫胺的降解速率常数由0.1435下降至0.0407，这可能是由于噻虫胺添加浓度的增大抑制了土壤中降解噻虫胺的微生物的酶活性，使微生物的代谢活动减弱，延缓了噻虫胺的消解。显著性检验结果表明，不同添加浓度的噻虫胺的降解速率均存在显著差异。

表4 不同添加浓度噻虫胺在土壤中降解的动力学参数

3.5 土壤微生物对噻虫胺降解的影响

噻虫胺在灭菌和未灭菌的土壤中的的残留量随时间的变化趋势均符合一级动力学方程(表5)。噻虫胺在未灭菌土壤中的降解速率比其在灭菌土壤中提高了3.28倍，半衰期由未灭菌条件下的10.78 d增加至灭菌条件下的35.37 d，说明微生物对噻虫胺在土壤中的降解具有明显影响，微生物可加速其降解，而水解和化学降解等非生物降解作用所产生的影响相对较小，噻虫胺在土壤中的降解速率主要由微生物决定。

表5 噻虫胺在灭菌与未灭菌土壤中降解的动力学参数

4 结论与讨论

本文在实验室模拟条件下对不同温度、添加浓度和土壤微生物对噻虫胺降解的影响进行了研究。土壤微生物对农药的降解起主要作用，环境的温度和农药的添加浓度等因素对农药的降解也有一定的影响。得出了以下主要结论。

(1)在15～30 ℃条件下，随着土壤温度的升高，噻虫胺在土壤中的降解速率呈升高趋势，可能的原因是：随着环境温度逐渐接近于降解农药的微生物的最适温度，微生物体内各种酶的活性不断增强，加快了微生物的代谢活动，从而加速了农药的降解；当土壤温度由30 ℃升至35 ℃时，噻虫胺的降解速率开始下降，这可能是因为当温度过高时，土壤微生物体内的酶活性受到抑制，使噻虫胺的降解速率下降。

(2)随着土壤中噻虫胺的添加浓度从0.1倍增加到2.0倍，其在土壤中的降解速率均逐渐下降。

(3)灭菌土壤的试验结果反映了非生物消解作用(包括水解、化学降解等)对农药降解的影响，而未灭菌土壤的试验结果反映了非生物消解和土壤微生物消解的共同作用。本试验中的噻虫胺在灭菌土壤中的降解半衰期均远大于在未灭菌土壤中的降解半衰期，说明土壤微生物对农药降解起主要作用。

综上所述，当温度在30～35 ℃，农药浓度适宜时，土壤微生物的活性最强，土壤中的噻虫胺降解最快。