日晒夜露酿造过程中酱油品质特性及其抗氧化分析

钟碧疆

(厦门古龙食品有限公司，福建 厦门 361000)

酱油起源于中国，是一种具有独特酱香的调味品。酱油中含有多肽、氨基质[1]。目前，我国的酱油生产工艺主要为低盐固态发酵法和高盐稀态发酵法[2]。低盐固态法酿造的酱油具有生产周期短、产量大等特点，占我国酱油产量的90%左右。高盐稀态法酿造的酱油采用控温发酵并在发酵过程中添加外源菌种，发酵周期一般为4～6个月，品质优于低盐固态发酵酱油，是酿造中、高品质酱油的发展趋势[3]。然而，高盐稀态发酵法与传统日晒夜露酿造法(6～12个月)相比缩短了周期，因此酱油的色泽、风味等仍存在一定差距[4]。传统酿造过程中酱醪发酵采用高盐稀态、日晒夜露和微生物复合发酵，酱油具有色泽红褐、体态浓稠、酱香醇厚等特点[5]。本文对酱油日晒夜露高盐稀态发酵过程中的品质变化规律及其抗氧化特性进行了系统研究，以期为生产高品质酱油提供一定的理论和技术指导。

1 材料

1.1 试验材料及试剂

黄豆：福建北大荒绿色食品有限公司；食用盐：福建盐业有限责任公司；2,2-联苯基-1-苦基肼基(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)、邻苯二甲醛(OPA)、9-芴甲氧羰基(FMOC)、氨基酸标准品、菲咯嗪：Sigma公司；磷酸氢二钠、四硼酸钠：Aladdin公司；乙腈、甲醇：Fisher Scientific公司；水杨酸、硫酸亚铁：国药集团化学试剂有限公司；米曲霉菌种：实验室保藏。

1.2 主要仪器与设备

PHS-25C pH计 上海康仪仪器有限公司；UV1801紫外-可见分光光度计 瑞利公司；WYT-4糖度计 泉州中友光学仪器有限公司；MA45水分测定仪 美国OHAUS公司；1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司；Kjeltec凯氏定氮仪 丹麦FOCC公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酱油的制作工艺

酱油生产工艺流程：黄豆→去杂→浸泡→蒸煮→冷却、出锅→加种曲和面粉→装匾制曲→曲室培养→入陶缸日晒夜露发酵(发酵1年成熟，抽油沉淀杀菌即为成品)→发酵过程中抽油取样于4 ℃冰箱贮藏待测→过滤(快速定性滤纸)→指标检测。

1.3.2 基本理化指标的测定

pH：每次测定前采用标准液(pH 4.01～7.00)校准，3次读数取平均值。

色率：参考孙宇霞和李丹等的方法[6,7]，使用最小二乘方回归法得到标准方程：y=0.2672x-0.0493(R2=0.9994)，式中：y为色率，x为吸光值A0。样品测定时将酱油原液稀释到一定倍数k，用分光光度计，以蒸馏水作为空白，测定样品在520 nm波长下的吸光度A0，将A0值乘以稀释倍数k后带入上式得色率。

色深物质含量：参考李莹等[8]的方法，将酱油稀释至一定倍数，测定其在420 nm处的吸光值A420，将A420乘以稀释倍数得色深物质。

红色指数和黄色指数：参考郑海燕和秦祖赠等的方法[9,10]，将过滤后的酱油样品稀释10倍，分别在波长460，510，610 nm下测定吸光值A1、A2、A3，红色指数由10×lg(A2/A3)表示，黄色指数由10×lg(A1/A3)表示。

盐度：参考GB 18186-2000《酿造酱油》中氯化钠的测定方法。

可溶性无盐固形物：参考胡志芬等[11]的方法，采用糖度计测定可溶性固形物含量并减去氯化钠含量，即为可溶性无盐固形物含量。

总酸：参考ZB/X 66037-87《总酸测定法》测定。

氨基酸态氮：采用甲醛滴定法[12]。

1.3.3 游离氨基酸的测定

参考安捷伦HPLC氨基酸分析方法。具体步骤为：准确吸取500 μL酱油样品于2 mL离心管中，加入等体积的10%三氯乙酸(TCA)震荡均匀，水浴30 min后12000 g离心15 min，上清经0.22 μm滤膜过滤，样品经过邻苯二甲醛(OPA)和9-芴甲氧羰基(FMOC)在线衍生后供高效液相色谱分析。色谱条件：色谱柱条件：AdvanceBio-AAA(4.6 mm×100 mm)，粒径2.7 μm；流动相A：10 mmol/L磷酸氢二钠和10 mmol/L四硼酸钠，pH 8.2；流动相B：甲醇∶乙腈∶水为45∶45∶10；流速1.5 mL/min；柱温40 ℃；检测波长338，262 nm。脯氨酸检测波长为262 nm，其他氨基酸检测为338 nm。标准曲线的制作：将氨基酸混合标准品(2.5 mmol/L)用0.1 mol/L的HCl稀释成0.1，0.5，1，2.5 mmol/L的混合标准溶液，经在线衍生后供高效液相色谱分析。

1.3.4 酱油产物分子质量分布的测定

酱油样品分子量的测定参照GB/T 22729-2008《海洋鱼低聚肽粉》中测定多肽分子量的方法。其中，标准样品为：小清蛋白,11950 Da；多肽, 5618 Da；杆菌肽, 1423 Da; GGAT, 451 Da; 酪氨酸，181 Da。色谱条件：所用色谱柱为TSK gel G2000 SWXL (7.8 mm×300 mm)；流动相为乙腈∶水∶三氟乙酸为45∶55∶0.1；进样体积为10 μL；流速为0.5 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为220 nm。所得数据应用GPC Offline软件进行分析，确定样品分子质量分布范围。

1.3.5 酱油样品抗氧化的测定

DPPH自由基(DPPH·)清除率的测定：参照Intarasirisawat等[13]的方法并稍作修改，400 μL酱油稀释样品和400 μL 0.1 mmol/L DPPH溶液混匀后避光保存20 min，反应结束后5000 g离心10 min，吸取上清在517 nm处测定吸光度。其中，对照组以去离子水代替样品，空白组用无水乙醇代替DPPH。EC50(mg/mL)表示DPPH·清除率为50%时所需要的样品干燥物浓度。计算公式：DPPH·清除率(%)=[1-(A样-A空)/A对]×100，式中：A样为样品组所测定的吸光度，A空为空白组所测定的吸光度，A对为对照组所测定的吸光度。

·OH清除能力的测定：参照Saidi等[14]的方法并适当修改，取200 μL样品、200 μL 9 mmol/L FeSO4、200 μL 9 mmol/L水杨酸和200 μL 8.8 mmol/L H2O2，定容至2.0 mL后于37 ℃条件下反应10 min，测定波长为510 nm。IC50(mg/mL)表示清除50%的羟自由基所需的样品干燥物浓度。计算公式为：·OH清除率(%)=[(A对-A样)/A对]×100，式中：A样为样品的吸光值，A对为对照组的吸光值。

1.3.6 感官评定

参考冯杰等[15-17]的方法，感官评定由8名实验室专业人士组成，分别从色泽、气味、滋味和体态方面进行评分，评定过程为先观色，再闻香，后品味，最终取8人评分结果的平均值为试验结果，感官评定的项目权重和评分分值范围见表1和表2。

表1 酱油感官评分项目的权重分配Table 1 Weight allocation of soy sauce sensory scoring items %

表2 酱油感官评定评分表Table 2 Soy sauce sensory evaluation scale

2 结果与分析

2.1 酱油酿造过程中成分的变化情况

由GB 18186-2000《酿造酱油》可知，色泽、可溶性无盐固形物、盐度、氨基酸态氮等指标是评价酱油等级的重要指标。

酱油发酵过程中色泽指标变化情况见表3。

表3 酱油酿造过程中色泽指标变化情况Table 3 Changes of color indexes in soy sauce brewing process

注：表中均值上标不同字母表示均值差异(P<0.05)。

由表3可知，酱油的色率、色深物质随着发酵时间的延长而不断增加，红色指数在发酵前3个月增加明显，3个月后增加不显著；黄色指数在发酵前5个月增加明显，后期增加不明显(P<0.05)。酱油蛋白质分解主要在第1个月，且酱油发酵过程被分解的还原糖、氨基酸、肽及蛋白质反应生成氨基糖，并经过一系列的化学反应，最终生成呈现棕红色的类黑色素。

酱油发酵过程中理化指标变化情况见表4。

表4 酱油酿造过程中基本理化指标变化情况Table 4 Changes of basic physical and chemical indexes in soy sauce brewing process

注：表中均值上标不同字母表示均值差异(P<0.05)。

随着发酵时间从1～12个月，氨基酸态氮略微增加但不显著(P<0.05)，可能是酱油中蛋白质的分解主要发生在1个月内。总酸略微增加但不显著(P<0.05)，发酵前5个月pH明显降低后变慢(P<0.05)，可能与日晒夜露为敞开式发酵，发酵过程中空气中的野生型乳酸和酵母菌等耐盐耐酸型菌落在发酵前期逐渐增多，产酸菌产酸有关。该酱油为日晒夜露式发酵，发酵过程中水分不断蒸发，并不断补充食盐水，故酱油的盐度逐渐增加。在补盐水过程中，盐度增加，可溶性无盐固形物略微降低[18]。

2.2 酱油中氨基酸含量

不同酿造阶段酱油中的氨基酸含量变化情况见表5。

表5 发酵阶段酱油中的游离氨基酸组成分析Table 5 Analysis of free amino acids in soy sauce during fermentation g/dL

续 表

随着发酵时间的延长，酱油中游离氨基酸的总量不断上升，12月份的值最高，含量均在8 g/dL以上。该结果表明酱油中蛋白质的分解主要发生在1个月内，后期增加不显著。同时，天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸随着发酵时间的延长逐渐增加，组氨酸、精氨酸和赖氨酸则减少。为了进一步探讨酱油的呈味性，对鲜味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸)、甜味氨基酸(丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸)；苦味氨基酸(组氨酸、精氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸)进行分类讨论[19]。结果发现发酵1～12个月，鲜味氨基酸含量呈波动式上升，总增加20.45%，占总氨基酸的比例由16.00%增加至18.60%；甜味氨基酸含量呈上升趋势，总增加16.00%，占总氨基酸的比例由21.21%增加至23.74%；而苦味氨基酸含量降低3.98%，占总氨基酸的比例由48.72%降至45.14%，降低3.58%。此结果表明，在发酵过程中，酱油的滋味变好。

2.3 酱油产品分子量成分测定

采用高效凝胶过滤法对不同酿造阶段的酱油进行分子质量分布测定，并应用GPC Offline软件进行分析。

表6 不同酿造阶段酱油分子量分布Table 6 Molecular weight distribution of soy sauce at different brewing stages

结果显示，随着发酵时间的延长，酱油多肽的变化不明显，各月份酱油多肽小于1000 Da均大于95%。该结果表明日晒夜露酿造酱油过程中，大豆蛋白的分解可能主要集中在第1个月内，结果与氨基酸态氮、固形物、氨基酸含量变化一致。

2.4 酱油成分抗氧化活性

DPPH可用来评价抗氧化物质的供氢能力，在517 nm处有特征吸收峰，可根据吸光度值来评价对自由基的清除能力。

图1 不同酿造阶段酱油的DPPH·清除率(A) 和·OH清除率(B)变化情况Fig.1 The DPPH·scavenging rate(A)and·OH scavenging rate(B)of soy sauce at different brewing stages

由图1中A可知，日晒夜露高盐稀态酿造酱油具有较强的DPPH·清除能力。随着酿造时间的延长，酱油产品DPPH·清除率逐渐加强。DPPH·清除能力的EC50由1个月时的1.66 mg/mL降低至0.66 mg/mL。同时，·OH清除率研究表明随着酱油酿造时间的延长，IC50下降明显，由1个月的0.50 mg/mL降至12个月的0.20 mg/mL。该结果表明日晒夜露酿造的酱油具备较好的抗氧化性。

2.5 感官分析

对不同发酵月份的酱油进行感官评分，评分结果见表7。

表7 酱油的感官评价特性Table 7 Sensory evaluation characteristics of soy sauce

注：表中均值上标不同字母表示均值差异(P<0.05)。

结果表明，随着发酵时间的延长，酱油体态愈浓厚，色泽鲜艳度及光泽度愈好，酱香及酯香愈浓，滋味鲜美，醇厚度愈好，评分结果同色值、色率、红色指数、黄色指数及鲜、甜味氨基酸含量随酿造时间延长总体上升趋势相一致。

3 结论

日晒夜露式高盐稀态酿造酱油在发酵过程中，酱油的色率、色深物质随着时间的延长而增加，红色指数在发酵前3个月增加明显。在发酵前5个月，黄色指数明显增加，且pH明显降低(P<0.05)。氨基酸态氮及总酸略微增加但不显著(P<0.05)。

日晒夜露高盐稀态酿造酱油，对比发酵1个月的原油及发酵12个月的成熟原油，鲜味氨基酸含量增加20.45%，甜味氨基酸含量增加16.00%，苦味氨基酸含量降低3.98%，酱油滋味变好，与感官评价结果一致。

随着发酵时间增加，日晒夜露高盐稀态发酵法酱油DPPH·清除能力的EC50及·OH清除率的IC50降低明显，体外抗氧化能力逐渐增强。