超声波-微波辅助溶剂提取胡椒鲜 果油树脂的工艺研究

吴桂苹,贾雯,谷风林*,谭乐和,张卫明,张锋伦

(1.中国热带农业科学院香料饮料研究所，海南 万宁 571533；2.国家重要热带作物工程技术 研究中心，海南 万宁 571533；3.海南省热带香料饮料作物工程技术研究中心， 海南 万宁 571533；4.南京野生植物综合利用研究院，南京 211100)

胡椒(PipernigrumL.)，又名黑川、白川、浮椒及王椒等，为胡椒科胡椒属多年生常绿藤本植物，是世界上重要的调味香料[1]。世界上胡椒主要分布在南美洲的中部和北部，主产国是印度、印度尼西亚、越南等，我国胡椒种植面积和产量分别居世界第6 位和第5 位。海南省是我国胡椒的主产区，种植面积和产量均占全国的90%以上，种植面积约33万亩，产量约3.8万吨，年均产值20 多亿元[2]。海南省已有70多年的胡椒种植和加工历史，但90%以上的胡椒鲜果被加工成白胡椒粒、白胡椒粉等初产品，极少部分被加工成黑胡椒，而白胡椒、黑胡椒等初产品的传统加工一般需要3～7天才能将其水分含量晒干至12%以下。胡椒鲜果中水分含量约70%～80%，含有少量的多酚类物质，具有较强的抗氧化活性[3]。胡椒油树脂是采用溶剂提取或超临界流体等技术将胡椒中的风味活性物质提取出来的混合膏状物，其主要成分是胡椒碱，其次是β-石竹烯、柠檬烯等风味物质[4]，已被列入食品添加剂，可作为肉类食品、调味产品、饮料和烈性酒等的调配香料[5]。国内外学者研究报道了溶剂提取[6-8]、超声波法[9]、微波提取法[10，11]、超临界流体萃取法[12]等不同方法提取胡椒油树脂的得率，并对胡椒油树脂中的化学成分进行了分析鉴定[13]。吴桂苹等研究报道了不同提取方法对黑胡椒油树脂得率及其胡椒碱含量的影响，发现超声波-微波协同萃取所得黑胡椒油树脂得率最高，Kelly等发现胡椒油树脂具有较强的抗菌活性[14，15]。但目前尚未见直接以胡椒鲜果为原料提取胡椒油树脂的研究报道，因此，本实验以胡椒鲜果为原料，采用超声波-微波协同萃取法提取胡椒油树脂，并对其加工工艺进行响应面优化，为胡椒鲜果的直接利用提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胡椒鲜果：由中国热带农业科学院香料饮料研究所提供，为印尼大叶种胡椒的果实。

无水乙醇(分析纯)：西陇化工股份有限公司；甲醇(色谱纯)：德国默克公司；胡椒碱(色谱纯，纯度>98.00%)： 北京世纪奥科生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

CW-2000超声波-微波协同萃取仪 上海新拓微波溶样测试技术有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司；HW.SY11型电热恒温水浴锅 常州恒隆仪器有限公司；MF15磨浆机 广州雷迈机械设备有限公司；HDM-100电热套 常州国华电器有限公司；AL104电子天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品预处理

将胡椒鲜果粒清洗干净，用磨浆机将其磨成浆，保存至4 ℃冰箱中待测。

1.3.2 单因素及响应面试验

单因素及响应面试验均在超声波-微波协同萃取仪中进行，其中，超声波选择开启，微波功率为300 W，提取温度为55 ℃，选取料液比(1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45)、乙醇浓度(60%、70%、80%、90%、100%)、提取时间(10，15，20，25，30 min)3个因素，以提取的胡椒油树脂得率与油树脂中的胡椒碱含量作为考察指标进行单因素试验。根据单因素试验结果，利用Design-Expert 8.0.6 Trial软件进行响应面试验设计，以胡椒油树脂得率和油树脂中胡椒碱含量为响应值，选取提取料液比、乙醇浓度、提取时间3个因素，采取三因素三水平响应曲面分析法进行提取工艺优化，试验因素水平值及编码值见表1。

表1 试验因素和水平Table 1 Factors and levels of test

1.3.3 胡椒碱含量测定

用高效液相色谱仪检测上清液中的胡椒碱含量，仪器检测条件参考国家标准GB 17582-2009，即以甲醇和水为流动相，体积比为77∶23，流速为1.0 mL/min，检测波长为343 nm，进样量为10 μL，外标法定量。即准确称取胡椒碱标准品0.0013 g，加入95%乙醇溶解后定容至10 mL棕色容量瓶中，取1.0 mL该溶液配制25 mL工作液，并用工作液配制不同浓度的标准溶液，过0.45 μm有机膜，用高效液相色谱仪检测。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制胡椒碱标准曲线，通过线性拟合得到回归方程：y=113.51x-47.69，相关系数为0.9963。

1.3.4 胡椒油树脂得率计算

1.4 数据分析

试验数据用Excel 2010、Origin 9.0、SPSS Statistics 20、Design-Expert 8.0.6 Trial软件及仪器自带软件处理，平均数之间的比较采用方差分析中的LSD与Duncan多重比较对比分析，差异显著性水平P<0.05和P<0.01。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对胡椒油树脂得率及油树脂中胡椒碱含量的影响

图1 料液比对胡椒油树脂得率及油树脂 中胡椒碱含量的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on yield of pepper oleoresin and content of piperine in oleoresin

由图1 可知，随着料液比的增加，胡椒油树脂的得率呈先缓慢增加后逐渐降低的趋势。在料液比为1∶35 (g/mL)时，胡椒油树脂得率和油树脂中胡椒碱含量都达到最高，分别为13.2%和34.212%，而且在料液比为1∶30～1∶35 (g/mL)之间，胡椒油树脂得率和油树脂中胡椒碱含量均有明显的变化趋势，因此，选择料液比的范围为1∶30～1∶40 (g/mL)。

2.1.2 乙醇浓度对胡椒油树脂得率及油树脂中胡椒碱含量的影响

图2 乙醇浓度对胡椒油树脂得率及油树脂 中胡椒碱含量的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on yield of pepper oleoresin and content of piperine in oleoresin

由图2可知，乙醇浓度在60%～70%之间油树脂得率呈现逐渐上升趋势，乙醇浓度达到70%后油树脂得率逐渐降低，在乙醇浓度70%时达到最大值。油树脂中胡椒碱含量在60%～90%之间慢慢趋于稳定，在乙醇浓度为100%时含量最高。由于此次试验以胡椒油树脂的得率为主要考察指标，所以综合考虑，乙醇浓度的选择范围为60%～80%。

2.1.3 提取时间对胡椒油树脂得率及油树脂中胡椒碱含量的影响

图3 提取时间对胡椒油树脂得率及油树脂 中胡椒碱含量的影响Fig.3 Effect of extraction time on yield of pepper oleoresin and content of piperine in oleoresin

由图3可知，油树脂得率与油树脂中胡椒碱含量都在提取时间为15 min时达到最高，分别为16.75%和23.262%，之后逐渐下降，且胡椒碱的含量慢慢趋于稳定。在提取时间为10～20 min左右时，油树脂得率与油树脂中胡椒碱含量均比较高，保持了一个良好的趋势。所以，选择提取时间的范围为10～20 min。

2.2 响应面试验

2.2.1 回归方程的建立与方差分析

在单因素试验的基础上，选取料液比、乙醇浓度、提取时间3个因素为自变量，分别表示为A，B，C。以胡椒油树脂得率与油树脂中胡椒碱含量为响应值，采用Box-Behnken设计进行响应面试验，试验结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计结果Table 2 Design and results of Box-Behnken test

利用Design-Expert 8.0.6 Trial软件对表2中的胡椒油树脂得率进行回归分析，得到的方差分析结果见表3，参照方差分析对模型的拟合进行了评价。该模型的P值等于0.0046，小于0.05，说明模型拟合性较好，失拟差P值等于0.0646，大于0.05，该模型的失拟性不显著，得到的多元二次回归模型为：

油树脂得率(R1)=16.00+0.050A-0.35B+0.40C+0.15AB-0.35AC+0.050BC-0.47A2-0.48B2-0.27C2。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

注：“*”代表差异显著，P<0.05；“**”代表差异极显著，P<0.01，下同。

由表3可知，其中B、C、A2和C2均达到显著(P<0.05)。由料液比(A)、乙醇浓度(B)、提取时间(C)3个影响因素的F值大小得知其对胡椒油树脂得率的影响大小排序为：C>B>A。除此之外，决定系数R2=0.8556，表明该方程能够解释85.56%的响应值的变化，试验误差较小，因此可以用该模型对胡椒鲜果油树脂的提取进行分析和预测。

同样利用Design-Expert 8.0.6 Trial软件对表2中胡椒油树脂中胡椒碱的含量进行回归分析，得到的方差分析结果见表3，该模型的P值等于0.0282，小于0.05，拟合性显著，失拟差P值等于0.2067，大于0.05，显示失拟性不显著，说明拟合的方程显著性良好，得到的多元二次回归模型为：油树脂中的胡椒碱含量(R2)=23.67+0.14A+1.47B-0.21C-0.00425AB+1.32AC+0.64BC+1.45A2+0.59B2+0.36C2。

由表3可知，B、AC和A2均达到极显著(P<0.01)，得知3个影响因素对油树脂中胡椒碱含量的影响大小排序为：B>C>A。同时，通过分析，油树脂中胡椒碱含量的R2值为0.9184，其校正决定系数的值为0.8134，表明油树脂中胡椒碱含量的模型拟合度较好，能够准确预测和分析工艺优化的结果。

2.2.2 各因素间的交互作用

根据回归方程，利用Design-Expert做因子间的响应面分析图和等高线图，因素间的交互作用对胡椒油树脂得率的影响见图4。

图4 因素间的交互作用对胡椒油树脂得率影响的 响应面图和等高线图Fig.4 Response surface map and contour map of the interaction of factors on the yield of pepper oleoresin

根据图4的响应面图和等高线图来分析料液比、乙醇浓度、提取时间对胡椒油树脂提取得率的影响。料液比和乙醇浓度对胡椒油树脂得率的影响最大，由其响应图和等高线可知，在提取时间一定的条件下，随着料液比的增加，油树脂的得率先逐渐增加后又急剧下降，此时料液比和乙醇浓度交互作用的响应面图的中心点处得到的胡椒油树脂得率最大，为16.174%；料液比和乙醇浓度对胡椒油树脂得率的影响次之，对胡椒油树脂得率影响最小的是乙醇浓度和提取时间交互作用，由图7可知，BC之间的等高线图形趋于圆形，说明其交互作用对油树脂得率影响不大。

根据图5的响应面图和等高线图来分析料液比、乙醇浓度、提取时间对胡椒油树脂提取得率的影响。料液比和提取时间对油树脂中胡椒碱含量的影响最大，显示为极显著，其次是乙醇浓度和提取时间，最后是料液比和乙醇浓度对油树脂中胡椒碱含量的影响。

图5 因素间的交互作用对胡椒油树脂中胡椒碱含量 影响的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface map and contour map of the interaction of factors on the content of piperine in pepper oleoresin

由响应面设计分析可知，胡椒油树脂得率的最优结果为：料液比1∶30.35 (g/mL)，乙醇浓度75.56%，提取时间20 min，预测的油树脂得率为15.6014%，油树脂中胡椒碱含量为25.0798%。油树脂中胡椒碱含量的最优结果为：料液比1∶30(g/mL)，乙醇浓度76.39%，提取时间20 min，预测的胡椒油树脂的得率为15.47%，油树脂中胡椒碱含量为25.408%。由响应面分析得到的油树脂得率和油树脂中胡椒碱含量的最优组合为：料液比1∶30 (g/mL)，乙醇浓度75.87%，提取时间20 min，这预测结果为油树脂得率15.52%，油树脂中胡椒碱含量为25.260%。基于实验以油树脂得率和油树脂中胡椒碱含量作为参考指标，选择可以得到较高油树脂得率和油树脂中胡椒碱含量的优化组合，即料液比1∶30 (g/mL)，乙醇浓度75.87%，提取时间20 min。

2.3 验证试验

为了检测和验证响应面的可行性和有效性，选取最优的提取条件进行3次平行验证试验，同时，考虑到实际操作的便利性和局限性，修改最优条件为料液比1∶30 (g/mL)、乙醇浓度76%、提取时间20 min，提取的胡椒油树脂得率为15.70%，油树脂中胡椒碱含量为25.680%，试验结果与预测值基本相符，说明曲面响应分析所得的模型是准确可靠的。

3 结论

在前期试验的基础上，以胡椒鲜果为原料，经过磨浆处理后，用超声波-微波辅助溶剂提取胡椒鲜果油树脂，并用响应面优化了提取工艺，结果显示：对胡椒鲜果油树脂得率影响大小顺序为提取时间>料液比>乙醇浓度，对油树脂中胡椒碱含量影响大小顺序为乙醇浓度>提取时间>料液比。优化胡椒鲜果油树脂的提取工艺参数为：料液比1∶30 (g/mL)、乙醇浓度76%、提取时间20 min，提取的胡椒油树脂得率为15.70%，油树脂中胡椒碱含量为25.680%。超声波-微波辅助溶剂提取法相对热回流提取、溶剂提取等方法而言，可将常规提取时间由3～7 h缩短至20 min，在胡椒油树脂得率上亦能由10%提高到15.7%。因此，胡椒鲜果可直接用于提取胡椒油树脂，不仅减少了晒干工序，节约了加工周期，而且增加了提取效率，为胡椒鲜果的直接利用和精深加工提供了科学依据。