香根油的提取及抑菌性研究

杨靖，苏海建，王刘东，闫启峰，白冰，杨鹏飞，罗海涛

(1.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，郑州 450002；2.山东中烟工业有限责任公司 技术中心，山东 青岛 266000；3.江苏中烟徐州卷烟厂品质管理处，江苏 徐州 221005； 4.湖北中烟工业有限责任公司技术中心，武汉 430040；5.江西中烟工业有限 责任公司技术中心，南昌 330096)

香根草(Vetiveriazizanioides)，又名岩兰草，是一种禾本科多年丛生的草本植物，作为经济植物早在20世纪50年代就由印度传入了中国，目前国内对香根草的开发主要集中在香根草精油的提取分析和香根草的生态应用方面[1-8]。香根油作为一种天然香料，广泛应用于食品、日化和烟草中，虽然香根草有一定的药用和保健性质[9]，但国内仅报道了香根草提取物对植物病原真菌的抑制作用[10]，其对细菌的抑菌性研究鲜有报道。本文采用超声波辅助提取技术提取香根油，采用GC-MS进行成分分析，并对其抑菌性进行了研究，为香根草的进一步开发利用提供了依据。

1 仪器与材料

6890/5973N型气相色谱/质谱联用仪 美国Agilent公司；KQ2200B型超声波提取装置 昆山市超声仪器有限公司；LA-230S型电子天平(感量0.001 g) 北京赛多利斯仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

香根草干根：市售，产自广东清远；无水乙醇、无水硫酸钠：AR，国药集团化学试剂有限公司；大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、地衣芽孢杆菌、高地芽孢杆菌：以上菌种均由郑州轻工业学院微生物实验室提供。

2 试验方法

2.1 香根油的提取

将香根草干根适当粉碎称重，放入500 mL三角瓶中，加入适量的无水乙醇，在超声波提取装置中萃取，取出三角瓶，抽滤，滤液经冷冻除蜡后在低温条件下旋蒸除去乙醇获得香根油。首先选择在不同的料液比、粉碎度、时间条件下进行单因素试验，在此基础上进行正交试验，确定超声波辅助溶剂萃取香根油的最佳条件。

2.2 GC-MS分析条件

色谱条件：HP-5石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；流量：1 mL/min；升温程序：起始温度60 ℃，保持2 min，以12 ℃/min升到180 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升到280 ℃，保持3 min。载气(He)流速1 mL/min，压力2.4 kPa，进样量l μL，分流比20∶1。

质谱条件：电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度190 ℃；质量扫描范围(m/z) 35～500，通过面积归一化法对鉴定出的化合物进行半定量，检索数据库为NIST 02。

2.3 抑菌性能研究

称取25 g肉汤培养基，18 g琼脂，加入1000 mL蒸馏水，加热溶解后分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。用于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌等的培养和抑菌试验。

采用倍比稀释法在96孔板中测定最小抑菌浓度(MIC)[11]，以一定浓度的青霉素钠做阳性对照。在MIC测定试验中，从无菌生长的液体培养基中取出20 μL涂布平板，在37 ℃继续培养24 h，观察有无菌落生长，无菌落生长的最小浓度即为最小杀菌浓度(MBC)。MIC试验中，为了保证精油与培养液的互溶性，需在培养液中加入1%的吐温80做乳化剂。

3 试验结果

3.1 料液比对产率的影响

准确称取60目的香根草粉末10 g，分别按照料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40的比例加入无水乙醇，超声萃取10 min，香根油的得率见图1。

由图1可知，香根油提取率随着液体比例增大而提高，当料液比达到1∶30时，香根油提取率最高，继续增加溶剂的量，提取效率略有降低，可能是因为溶剂过量会造成超声作用不完全，不能将所有的细胞壁震破，而导致提取效率偏低，而且会增加后处理的浓缩时间，造成精油的挥发损失。

图1 料液比对产率的影响Fig.1 Effect of ratio of material to liquid on extraction efficiency of vetiver oil

3.2 粉碎度对产率的影响

分别准确称取20，40，60，80，100目香根草粉末10 g，按照料液比1∶25加入无水乙醇，超声萃取10 min，香根油的得率见图2。

图2 粉碎度对产率的影响Fig.2 Effect of mesh number on extraction efficiency of vetiver oil

由图2可知，香根油提取率随着粉碎度的提高而增大，但超过80目后变化不大，继续增加目数会提高成本。

3.3 时间对产率的影响

准确称取60目的香根草粉末10 g，按照料液比1∶25加入无水乙醇，分别超声萃取5，10，15，20，25 min，香根油提取率见图3。

图3 时间对产率的影响Fig.3 Effect of time on extraction efficiency of vetiver oil

由图3可知，香根油提取率随着时间的延长呈上升趋势，当超声时间达到20 min时，香根油提取率最大，随着超声时间的继续延长反而下降，这可能是由于超声时间长，溶液温度逐渐上升，对香根油挥发性有一定影响。

3.4 正交试验

综合单因素试验结果，对影响超声波萃取的主要因素进行了三因素三水平试验，试验因素及水平见表1，试验结果见表2。

表1试验因素及水平
Table1Theexperimentalfactorsandlevels

水平因素A料液比(g/mL)B粉碎度(目)C提取时间(min)11∶25601021∶30801531∶3510020

表2 正交试验结果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2可知，各因子对提取率的影响依次为料液比>提取时间>粉碎度，由正交试验得出最佳工艺条件为A2B3C3，即料液比为1∶30，粉碎度为100目，提取时间为20 min。在此条件下进行验证试验，香根油的提取率为5.98%，高于任一单因素试验，可以确定此为最佳条件。

3.5 成分分析

香根油成分经GC-MS分析，以计算机检索谱库确定化合物，以质谱离子峰面积百分数表示各成分含量，分析结果见表3。

表3 香根油化学成分分析结果Table 3 The analysis results of chemical compounds of vetiver oil

续 表

由表3可知，香根油提取物中共鉴定出匹配度75%以上的挥发性成分24种，含量占全部萃取物的35.77%，其中烷烃类物质7种，萜烯类物质7种，醇类物质5种，酮类物质2种，酯类物质1种，酚类物质1种，杂环类物质1种，萜烯类化合物是香油根油的主要成分。

3.6 抑菌结果

香根油和青霉素钠对不同细菌的最小抑菌浓度(MIC)以及最小杀菌浓度(MBC)测定结果见表4和表5。

表4 香根油的最小抑菌浓度(MIC)Table 4 The minimum inhibitory concentration(MIC)of vetiver oil mg/mL

表5 香根油的最小杀菌浓度(MBC)Table 5 The minimum bactericidal concentration(MBC)of vetiver oil mg/mL

由表4和表5可知，香根油对6种细菌都具有一定的抑菌和杀菌能力，其中对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最好，其最小抑菌浓度(MIC)为0.233 mg/mL，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力相对最差，其最小抑菌浓度分别为1.104，1.256 mg/mL；香根油对枯草芽孢杆菌的杀菌效果最好，最小杀菌浓度(MBC)为0.463 mg/mL，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果最差，最小杀菌浓度分别为2.25，2.5 mg/mL，对其他3种细菌的杀菌能力较一致。原因是精油中含有一定量的异丁香酚和甲酸龙脑酯，同时还含有大量的萜烯类化合物，具有广泛的抑菌和抗氧化能力。

4 结论

对超声波萃取香根油的影响因素进行了研究，分别探讨了料液比、粉碎度和时间对提取率的影响，在单因素试验的基础上进行正交试验，得到香根油的最佳提取工艺条件为：以无水乙醇为溶剂，料液比1∶30，粉碎度100目，提取时间20 min，香根油提取率5.98%；通过GC-MS从香根油中共鉴定出24种化合物，占总萃取物的35.77%，主要是萜烯类化合物；香根油对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、地衣芽孢杆菌、高地芽孢杆菌均有一定的抑菌能力，可以对其抗菌机理进行进一步研究。本研究结果可以为开发一种新的天然抑菌剂，进而为香根草的综合利用提供理论支持。