植物功能盐对小鼠急性化学性肝损伤的防护实验研究

陈亮，周沫希，严雅丽，张英

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江省农产品加工技术研究重点实验室， 浙江省食品加工技术与装备工程研究中心，杭州 310058)

传统的“竹盐”是将粗的海盐(又称原盐)放入新鲜的楠竹筒中，在800～1300 ℃的高温下反复烤制而成，著名的“紫竹盐”就是通过9次循环填充、烤制得到的，故又称九烤竹盐，以韩国产的“仁山紫竹盐”最为有名[1,2]。已有研究表明，竹盐具有保护胃肠道[3]、减轻肝肾负担[4]、抑菌消炎[5,6]、护肤养颜等功效[7,8]。笔者科研团队前期的研究工作也已证明，紫竹盐能够防止血液酸化，对慢性代谢性酸中毒大鼠的肾脏疾病具有良好的防护效果。

本文所涉及的“植物功能盐”是笔者科研团队近年来发明的新产品，是将原盐与不同的植物提取物适量混合后，采用特殊的高温熔炼技术得到的不同色泽的功能性盐，如紫色的竹盐、粉色的松盐和绿色的梅盐，即是由竹、松、梅等植物提取物与原盐在高温下共融后重结晶而成。调整植物提取物的种类及其与原盐的比例关系、烤制的温度和时间、不同温度下的保温时间及其升降温速率等工艺参数，即可获得不同形态、不同风味和不同功能的植物盐系列产品[9]。

众所周知，肝脏是人体最大的代谢和解毒器官，因而也是最容易遭受毒物攻击的靶标[10]。近年来，急性肝损伤的发病率呈逐年增加的趋势，药物滥用约占临床急性肝损伤发病率的50%[11,12]，占非病毒性慢性肝炎患者的20%～50%[13,14]，占爆发性肝功能衰竭患者的15%～30%[15]；急性肝损伤更易对儿童造成永久性伤害，临床上约有20%的肝功能衰竭者为儿童[16]。当前，治疗化学性肝损伤的主要药物有肌醇、肝泰乐、联苯双酯等。其中，联苯双酯(Bifendatatum)是治疗病毒性肝炎和药物性肝损伤的常用药物，认为能保护肝细胞、增加肝脏解毒功能，尤其是能显著抑制转氨酶活性的升高，且毒性低，副作用小。

本文拟采用四氯化碳(CCl4)诱导的急性小鼠肝损伤模型，以仁山紫竹盐为阳性食物对照、联苯双酯为阳性药物对照，评价3种植物盐(竹盐、松盐和梅盐)对小鼠急性化学性肝损伤的保护作用，以期为这种新型植物功能盐在食品、健康、医疗、保健领域中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原材料与仪器设备

原盐(日晒海盐)来自山东潍坊，实测NaCl含量为93.36%。3种植物功能盐：竹盐(外观蓝紫色，NaCl含量为88.83%)、松盐(粉红色，NaCl含量为90.32%)和梅盐(亮绿色，NaCl含量为91.74%)均由笔者实验室自制，即将原盐与不同比例的竹盐、松盐、梅盐提取物混合均匀后，在800～1400 ℃的高温下熔炼而成；仁山紫竹盐为市售产品，韩国Insan竹盐有限公司出品；联苯双酯滴丸，北京协和药厂生产；化学纯NaCl，Sigma产品。

5周龄雄性C57BL/6小鼠，平均体质量为(16.0±2.0) g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，由上海市实验动物质量监督检验站鉴定，合格证号为SCXK(沪) 2017-0005。动物实验的伦理认证编号为10319#(浙江中医药大学动物实验中心)。小鼠常规饲料(含2%食盐)由南通特洛菲饲料科技有限公司提供，同时委托其专门加工了无盐基础饲料。

丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA法)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒(羟胺法)、还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(微板法)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒(比色法)，均购自南京建成生物工程研究所。

全自动生化检测仪 日本Hitachi仪器公司；Thermo Varioskan Flash酶标仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；CKX41显微镜 日本奥林巴斯株式会社。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组与试验设计

取5周龄的SPF级C57BL/6健康雄性小鼠45只，适应性喂养1周后随机分成9组，试验设计及剂量配制见表1。

表1 动物试验分组及给药剂量Table 1 Grouping and dosing of animal test

注：为了确保试验数据的可比性，正常对照组分别设置了含2%食盐的常规饲料组(1#)和灌胃等质量的纯NaCl水溶液、同时摄食无盐饲料的对照组(2#)。

除正常对照组(1#)采用常规饲料外，其余8组均使用无盐基础饲料。给药阶段，根据世界卫生组织推荐的每人每日食盐摄入量5 g及标准动物等效剂量折算法得出小鼠的口服剂量[17]，每日灌胃1次，连续21天。饲养环境温度为(22±2)℃，相对湿度为50%～70%。

1.2.2 急性肝损伤动物造模

末次给药1 h后，模型对照组和试验组(3#～9#)小鼠均腹腔注射0.1% 的CCl4橄榄油溶液，CCl4剂量为10 mL/kg·bw，正常对照组(1#～2#)给予等体积的橄榄油，禁食过夜[18]。

1.2.3 试样采集及生化指标测定

在注射CCl4橄榄油溶液16 h后，脊椎脱臼处死小鼠，立刻摘眼球取血，同时解剖小鼠取肝脏。

血液样本，经3500 r/min离心10 min后，吸取上层血清用于血生化指标测定。取出完整肝脏后，剪取0.4 g肝脏组织1份，放入装有PBS(pH为7.4)的冻存管中匀浆，其余肝脏组织放入冻存管中，于-80 ℃冰箱中保存留用。将剪取的0.4 g肝脏匀浆后置于超低温离心机中离心(4000 r/min、20 min)，取上清液，测定其丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的含量以及总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)的活性(考马斯亮蓝法)[19]。

1.2.4 肝组织的病理观察

取各组试验鼠相同部位的肝组织，冷生理盐水冲洗干净后用中性福尔马林固定，制作4 μm的石蜡切片，进行HE染色，在显微镜下观察其形态学的变化。

1.3 统计方法

试验数据均采用平均值±标准误差(x±s)表示，对数据进行方差齐性检验；组间数据比较采用单因素方差分析。使用SPSS 19.0统计软件的单因素方差分析(ANOVA)中的Duncan检验分析显著性，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 植物功能盐对试验小鼠体重的影响

在为期21天的试验周期内，各试验组小鼠的体质量随饲养时间的延长而增长，均未表现出显著性差异(P>0.05)；同时观察到各组小鼠皮毛光滑，临床活动表现均正常，健康状况良好。试验周期中不同时间节点采集的各组试验小鼠的体质量情况见表2。

表2 试验周期中各试验组小鼠的体质量比较Table 2 Comparison of body weights of mice in each experimental group during the experiment period

注：同一列两两之间若字母完全不同，则两者之间存在显著差异(P<0.05)。

2.2 植物功能盐对化学性肝损伤小鼠血清中转氨酶活性的影响

表3 各试验组小鼠血清中转氨酶活性的比较Table 3 Comparison of activities of ALT and AST in serum of mice in each experimental group

注：同一列两两之间若字母完全不同，则两者之间存在显著差异(P<0.05)；模型对照组(3#)与NaCl对照组(2#)相比，“#”表示P<0.01；各试验组(4#～9#)与模型对照组(3#)相比，“*”表示P<0.01。

由表3可知，模型组(3#)小鼠血清谷氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性均极显著地高于正常对照组(2#和1#)(P<0.01)，表明造模成功。3种植物功能盐均表现出不同程度的降低血清转氨酶的活性，而原盐几乎无作用。与模型组相比，3种植物功能盐抑制ALT活性升高的作用极其显著(P<0.01)；在抑制AST活性升高上，3种植物功能盐也有极显著(P<0.01)的作用，表明竹盐、松盐和梅盐具有一定的保肝护肝功效。松盐对CCl4所致的急性肝损伤小鼠血清转氨酶急剧升高的抑制作用优于竹盐和梅盐。然而，阳性药物对照组(联苯双酯)虽然具有最强的抑制ALT活性的功效，但却对AST无作用。市售的仁山紫竹盐也和原盐一样，未表现出对急性化学性肝损伤小鼠血清转氨酶活性的抑制作用。

2.3 植物功能盐对化学性肝损伤小鼠氧化应激指标的影响

试验动物受到化学毒物攻击时，急性肝损伤的一个重要表征是强烈的氧化应激反应，即，伴随着肝脏组织中脂质过氧化导致的MDA含量升高、GSH水平降低、SOD活力下降等。由表4可知，同样摄入无盐饲料，并同时灌胃4%纯NaCl的两组(2#和3#)用CCl4造模以后，各项氧化应激指标都发生了显著变化，尤其是GSH和MDA水平的改变极其显著(P<0.01)，表明灌胃CCl4后动物的肝脏受到了氧化损伤。

表4 各试验组小鼠肝脏组织的抗氧化活性比较Table 4 Comparison of antioxidant activity in liver tissue of mice in each experimental group

注：同一列两两之间若字母完全不同，则两者之间存在显著差异(P<0.05)；模型对照组(3#)与NaCl对照组(2#)相比，“#”表示P<0.01；各试验组(4#～9#)与模型对照组(3#)相比，“*”表示P<0.01。

由表4可知，3种植物功能盐均可一定程度地升高，受损肝脏的GSH含量，其中梅盐表现出极显著(P<0.01)的提升作用；且均能降低受损肝脏的MDA含量，其中作用最强的是梅盐(P<0.01)，其次是仁山紫竹盐和松盐(P<0.05)；联苯双酯组也表现出升高GSH和降低MDA含量的作用，但效果均不如梅盐。在提升受损肝脏内源性抗氧化酶活性方面，3种植物功能盐均表现出一定作用，其中竹盐表现出对T-SOD活性的显著提升作用(P<0.05)。

2.4 试验动物肝脏损伤及其修复的组织病理学观察

各组小鼠肝组织病理切片的形态学观察结果见图1。

1#和2#是正常小鼠的肝组织，可见肝细胞索排列整齐，细胞边界清晰，细胞核型正常，无明显异常；3#NaCl模型组的肝细胞索排列紊乱，细胞核型发生明显变化，中央静脉中有大量细胞浸润；4#联苯双酯组的肝细胞索排列较清晰，细胞核型正常，有少量空泡变性，表明联苯双酯滴丸对急性肝损伤有治疗作用；5#仁山紫竹盐组的肝细胞索排列较清晰，细胞核型正常，有少量空泡变性和水样变性；6#原盐对照组的肝细胞索排列不整齐，细胞核型发生明显变化，中央静脉中有大量细胞浸润；7#竹盐试验组的肝细胞索排列较清晰，细胞边界清晰，细胞核型正常，有少量空泡变性；8#梅盐试验组的肝细胞索排列清晰，细胞核型正常，有少量空泡变性；9#松盐试验组的肝细胞索排列较清晰，细胞核型正常，有少量空泡变性，中央静脉中有少许细胞浸润。根据肝脏组织病理切片的形态学检查结果，可见竹盐、松盐、梅盐均对CCl4所致的小鼠急性肝损伤有一定的防护作用。

图1 植物功能盐对试验小鼠肝脏组织病理学的影响(×400)Fig.1 Effect of plant functional salts on liver histopathology in experimental mice(×400)

注：1#为常规饲料对照组；2#为NaCl对照组；3#为NaCl模型组；4#为联苯双酯组；5#为仁山紫竹盐组；6#为原盐对照组；7#为竹盐试验组；8#为梅盐试验组；9#为松盐试验组。

3 讨论

我国是世界肝病大国，预测到2020年，慢性肝病人数将达4.5亿。肝病高发的国情在很大程度上与食物来源、饮用水、饮食习惯和餐饮方式等有关。我国居民的食用盐主要来自海盐，日晒海盐(原盐)即海水的浓缩物，海洋中所有的污染物都有可能留存其中，带来一定的食品安全隐患。本研究结果显示，摄入原盐的试验小鼠(6#)肝脏中GSH水平极显著地(P<0.01)低于摄入同等剂量纯NaCl的组(2#)，(871.63±4.67)～(919.71±32.44) nmol/g prot，表明原盐中的确可能存在一些对肝脏不利的危害因素，引起了肝脏的氧化应激。与此同时，3种植物功能盐均可显著抑制ALT(P<0.01)和AST(P<0.05)的活性升高，而原盐却无作用。

在本研究的试验设计中，为了排除小鼠日粮中食盐的干扰，专门定制了无盐的基础饲料用于2#～9#小鼠喂养, 除联苯双酯的阳性药物对照组外，各试验组的食盐摄入量均为800 mg/kg·bw·d左右。在为期21 天的干预试验后，最终结果显示，仁山紫竹盐(5#)与原盐(6#)对小鼠血清转氨酶活性无明显影响，说明采用传统方法烤制的竹盐从竹筒中吸收到的有效成分是有限的。然而，2013年有文献报道[20]，传统方法烤制的竹盐可以抑制CCl4诱导的SD大鼠急性肝损伤，其试验设计采用常规含盐饲料作为大鼠(7周龄)日粮，并在此基础上灌胃400 mg/kg·bw·d的试样精盐、原盐、一烤竹盐和九烤竹盐(即紫竹盐)，连续灌胃14 天，结果表明竹盐可显著降低SD大鼠血清中的ALT和AST水平(P<0.05)，且九烤的效果优于一烤，与此同时原盐对照组也表现出了一定的活性。导致本研究结果与文献报道不符的原因可能是多方面的，譬如：原盐来自不同的海域，其附带的成分具有显著差异；试验剂量的不同，文献[21]并未排除日粮中食盐的干扰，常规日粮以2.0 %的含盐量计，大鼠通过日粮摄入的食盐约为1000 mg/kg·bw·d，再加上400 mg/kg·bw·d的试验盐，其总摄入量为1400 mg/kg·bw·d，远高于本研究的试验剂量(约800 mg/kg·bw·d)；采用传统工艺生产的竹盐难以实现标准化，故不同来源的竹盐样品可能存在显著差异。

笔者认为，植物功能盐的保肝护肝作用主要源自两个方面：一是与原盐共融的植物提取物，二是高温熔炼的过程。对于植物功能盐来说，虽然所添加的某种植物化学素(或植物提取物)原型物具有保肝护肝的作用，但经过800～1300 ℃的高温熔炼，其中的有机质应已完全失去，可能仅是剩余的无机物与原盐发生了反应，从而使得食盐的晶体结构、理化特性等随之发生改变, 进而影响其生物学功效。如陈湄沁测得5%的竹盐水溶液的pH值为10.98，而同等浓度的原盐水溶液为5.99；同时竹盐较原盐含有更多的钾、钙、钠、镁、铜、锌和铁等元素；并由此通过体内及体外实验，发现了竹盐对慢性酸中毒以及胃肠道癌症的作用。文献[21]测得10%的竹盐水溶液的pH达11.04，且比原盐和精制盐含更多的钾、钙、镁和锰元素；同时竹盐还表现出更高的电位还原能力，含有更多的羟基，有更好地清除自由基的能力。以上文献中提到的竹盐理化特性的变化均引起了生物学效应的改变，而对于晶体结构与生物学效应之间的关联，还有待进一步的研究，文献[22]表明食盐的颜色与NaCl晶格的着色中心有关。总之，鉴于食盐与人类健康之间的高度关联性，这是一个亟待进行深入系统的研究和探索的领域。