Box-Behnken响应面法优化有机硅季铵盐包合物的制备工艺

帅方舟，陈靖文，林华庆

(广东药科大学药学院/广东省药物新剂型重点实验室，广东 广州 510006)

在众多类型的抗菌剂中，有机硅季铵盐{二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵，SQ5700}是一种综合性能比较理想的抗菌剂浓缩液，可与任何比例的水、醇类、酮类、酯类烃类和氯化烃类相混溶，保存于甲醇溶剂中。该抗菌剂也是一类新型的阳离子表面活性剂，它对人体皮肤无刺激、无致癌作用，各项指标符合国内外对抗菌剂的要求[1]。甲醇有一定的毒性，长期使用对人体有一定的损害，而且甲醇易燃，其运输成本和危险性都很高。如果把有机硅季铵盐以水作为溶剂保存，不但可以降低对人体的危害，而且还可以降低成本。但是，有机硅季铵盐在水中会被水解，因其分子中含有三甲氧基硅基，在水中水解为硅羟基，容易缩聚为不溶于水的网状聚硅氧烷，在4～8 h内就会失去活性，故只能保存于有机溶剂中。本研究旨在寻找一种有效的方法，使得有机硅季铵盐可以在水中保持稳定[1-5]。

环糊精(β-CD)包合可以有效提高药物稳定性，在药品领域中应用广泛。羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)是经过修饰的β-CD，通过对β-CD的羟丙基化，破坏分子内氢键，显著提高了水溶性，具有局部刺激性、不良反应轻微等诸多优点[6-7]。

Box-Behnken试验设计法是响应面设计法的一种，它可以提供3到10个因素，高、中、低三水平的实验设计及分析，可以考察各个因素对效应(包封率)的影响以及各因素间的交互作用，也能进行各个因素的最优化。该方法使用方便，比单因素考察更全面客观，而且预测实验结果接近实际实验结果，因此被广泛地用于药学研究中[8-10]。本研究采用溶液-搅拌法制备了有机硅季铵盐-羟丙基-β-环糊精包合物(SQ5700-HP-β-CD包合物)，通过Box-Behnken试验设计对影响包合物制备的因素进行优化考察，筛选出最佳的制备工艺。

1 仪器与材料

ZK-82A真空干燥箱(上海市实验仪器总厂)；C-MAG HS 4磁力搅拌器(德国艾卡 RCT basic)；DSC4000差示扫描量热仪(美国珀金埃尔默仪器有限公司)；Spectrum100傅里叶变换红外光谱仪(美国珀金埃尔默仪器有限公司)；BS224S万分之一电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；有机硅季铵盐(SQ5700，湖南利洁生物集团股份有限公司)；羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD，淄博千汇生物有限公司)；丙酮(天津大茂化学试剂厂)；去离子水(广州亚飞水处理设备有限公司)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 SQ-5700-HP-β-CD包合物的制备

为避免在制备包合物的过程中SQ5700与水接触导致水解失活，选择无水乙醇作为溶剂溶解SQ5700；在制备方法上，由于乙醇的冰点为-117.3 ℃，冷冻干燥法中冻干机无法使无水乙醇到达冰点升华，选用溶液-搅拌法制备包合物[11]：精密称取一定量的HP-β-CD于烧杯中，用无水乙醇配制成饱和溶液，搅拌并溶解。在一定温度、一定转速下，加入一定量的SQ5700，搅拌一定时间后，真空干燥，得SQ5700-HP-β-CD包合物粗品，丙酮洗涤，真空干燥挥去丙酮，既得SQ5700-HP-β-CD包合物。

2.2 SQ5700质量分数的测定

2.2.1 0.004 mol/L十二烷基硫酸钠标准溶液的配制 精密称取十二烷基硫酸钠0.288 5 g(精确至0.000 1 g)，置于250 mL容量瓶中，加入去离子水至刻度定容，摇匀，备用。

2.2.2 混合指示剂的配制 精密称取溴化乙啶(0.5±0.005)g，置于50 mL烧杯内，再精密称取酸性蓝(0.25±0.005)g置于另一个50 mL烧杯中，用体积分数10%乙醇20～30 mL于40 ℃左右搅拌使溶解。精密移取2种溶液至同一个250 mL容量瓶内，用体积分数10%乙醇冲洗烧杯，洗液并入容量瓶，加入去离子水至容量瓶刻度线定容，摇匀后即得储备液，备用。精密移取20 mL储备液于500 mL容量瓶中，加适量蒸馏水，再精密移取245 g/L H2SO4溶液20 mL，用去离子水定容至刻度，摇匀，避光贮存。

2.2.3 SQ-5700质量分数的测定 根据文献[12]以及中华人民共和国国家标准GBT 5174-2004《表面活性剂洗涤剂阳离子活性物含量的测定》，选用溴化乙啶-酸性蓝滴定法测定SQ-5700的质量分数：常温下，精密称取SQ5700-HP-β-CD包合物10 g，置于100 mL容量瓶中，加入适量去离子水超声15 min进行溶解，冷却至室温，继续加入去离子水稀释至容量瓶刻度线。精密移取样品溶液5 mL至100 mL具塞量筒中。分别加蒸馏水2 mL，三氯甲烷3 mL，混合指示剂溶液2 mL，混合均匀。用十二烷基硫酸钠标准溶液滴定，标准溶液滴加后加塞剧烈振动，然后静置分离，当接近终点时，摇动而形成的乳浊液极易破乳，继续逐滴滴定并反复猛烈摇动，直至蓝色褪去，三氯甲烷层为浅灰-粉红色即达终点。准确记录滴加标准溶液的体积，按以下公式计算SQ-5700的质量分数：

式中：X为SQ-5700的质量分数；V为滴定消耗的十二烷基硫酸钠标准溶液的体积，mL；C为十二烷基硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L；M为有机硅季铵盐的分子量，M=496.28；m为称取样品的质量，g。

2.2.4 专属性考察 根据文献[9]，按“2.1”项方法在相同条件下制备6组等量且不含SQ5700的包合物，用“2.2.3”项方法进行测定，6组滴定试验均为阴性。另制备6组含有SQ5700的包合物，但不经过丙酮洗涤，对比未经包合的相同质量的SQ5700，结果测得包合物中SQ5700的平均质量分数与未经包合的SQ5700的相差小于0.2%，说明HP-β-CD对测量结果无影响，即可对SQ-5700-HP-β-CD包合物以同样方法测定SQ5700的质量分数。

2.2.5 精密度试验 精密称取同一批SQ5700原料药2 g，6份，分别用“2.2.3”项下方法进行测定，记录消耗标准溶液的体积，结果测得消耗标准溶液的RSD数值为0.45%，小于2%，说明方法精密度良好。

2.3 包封率的测定

包封率按公式“包封率=m/M×100%”计算，其中m为包合物中SQ5700的质量，M为总投入的SQ5700的质量。

2.4 包合物的工艺优化

2.4.1 单因素考察 根据相关文献报道，并在预试验的基础上，在考察最佳包合工艺时，选取包合温度、搅拌时间、壁芯比(HP-β-CD∶SQ-5700，质量比，下同)和转速为主要影响因素，并以包封率为指标进行单因素考察。

2.4.1.1 壁芯比对包合效果的影响 固定包合温度为40 ℃，搅拌时间为40 min，转速为500 r/min，以包合率为指标，考察壁芯比分别为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1时的包合效果。结果显示，壁芯比由1∶1升高到2∶1时，包封率从82.36%增加至89.82%，但随着壁芯比的进一步升高，包封率有所下降并逐渐趋于稳定，最后选用壁芯比为1∶1、2∶1、3∶1。

2.4.1.2 包合温度对包合效果的影响 固定搅拌时间为40 min，壁芯比为2∶1，转速为500 r/min，以包合率为指标，考察包合温度分别为30、35、40、45、50 ℃时的包合效果。结果显示，包合温度由30 ℃升高到40 ℃时，包封率从81.44%增高到90.04%，但随着温度的升高，包封率有所下降并逐渐趋于稳定，最后选用包合温度为35、40、45 ℃。

2.4.1.3 搅拌时间对包合效果的影响 固定包合温度为40 ℃，壁芯比为2∶1，转速为500 r/min，以包合率为指标，考察搅拌时间分别为20、40、60、80、100 min时的包合效果。结果显示，搅拌时间由20 min到40 min时，包封率从78.42%增高到89.94%，但从40 min之后包封率开始下降并趋于稳定，最后选用包合时间为20、40、60 min。

2.4.1.4 转速对包合效果的影响 固定包合温度为40 ℃，搅拌时间为40 min，壁芯比为2∶1，以包合率为指标，考察转速分别为100、300、500、700、900 r/min时的包合效果。结果显示，包合物的包封率无明显变化。

2.4.2 Box-Behnken响应面法优化包合物制备工艺

2.4.2.1 Box-Behnken响应面设计方案及结果 根据单因素考察的基础，选择壁芯比、搅拌时间、反应温度作为考察对象，以包封率(Y)作为评价指标对制备工艺进行优化，根据Box-Behnken试验的设计原理采用三因素三水平响应面法优化SQ5700-HP-β-CD包合物的包合条件，采用Design expert 8.0.6软件设计三因素三水平的响应面试验，共17组实验，包括5组中心点实验，求取最优的提取工艺参数，试验设计方案和结果见表1。

表1 Box-Behnken设计与结果Table 1 Box-Behnken design and results

2.4.2.2 模型拟合 根据包合物包封率指标对影响因素进行二次多项式数学模型拟合结果：Y=-18.82+2.706 5A+0.680 8B+4.552 2C+0.198 8AB+0.079 5AC+0.012 9BC-1.402 3A2-0.000 294 31B2-0.051 7C2。由表2的方差分析可知，该数学模型P值小于0.000 1，说明该模型极其显著。失拟项P值大于0.05，表明不显著，即该数学模型在被分析的整个回归趋于内拟合较好。该方程的多元相关系数R2为0.987 1，进一步说明模型有较好的拟合度。因素A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2为显著影响因素，说明对包合物包封率影响较大。因此，回归方程可以较好地描述各个因素与响应值(包封率)之间的关系，可以利用该回归方程找出HP-β-CD包合SQ5700的最优条件。

2.4.2.3 影响因素的响应面曲线图 根据Box-Behnken软件绘制不同影响因素对于响应值的三维曲图：分别固定3个影响因素其中之一，考察其他2个因素对包合物包封率影响的响应曲面图，结果见图1。图1A显示，当壁芯比较低时，包封率随包合温度的升高而增大，但随壁芯比的增加，包封率呈现先增大后减小的趋势。同理，在包合温度较低时，包封率随壁芯比的增大而增大，但到达一定温度后，包封率又开始下降。图1B显示从包合开始，包封率随壁芯比增加而变大，但时间到达一定值后，包封率开始下降。原因可能是在壁芯比量较高时，分子运动受阻，阻碍了包合过程的进行。图1C显示不同包合温度下，包封率随时间的延长呈先增大后减小的趋势；不同的搅拌时间的情况下，随包合温度的升高，包封率也是同样的出现先增大后减小的趋势。

表2 方差分析结果Table 2 The Analysis of variance

2.4.2.4 最佳工艺验证试验 根据Box-Behnken响应面试验设计结果，并结合包合物的制备工艺，得到优化条件为：壁芯比2.38∶1，搅拌时间31.22 min，包合温度41.94 ℃。为了方便实验，把参数调整为壁芯比2.4∶1，搅拌时间31 min，包合温度42 ℃。按照优化后的工艺参数，制备3批样品分别测定其包封率，结果得理论包封率为90.49%，实测包封率为93.66%，实测值与理论计算值偏差小于5%，模型选用合理有效。

2.5 包合物的检测

2.5.1 差示扫描量热法

分别称量HP-β-CD、SQ5700与HP-β-CD物理混合物和SQ5700-HP-β-CD包合物样品4.00～7.00 mg，置坩埚中进行压片密封，分别进行测定，测定条件为：N2流速30 mL/min，以10 ℃/min的升温速率在30～300 ℃条件下测定样品的热性质[13-15]，结果见图2。

A.壁芯比和包合温度对包封率的影响； B.壁芯比和搅拌时间对包封率的影响； C.搅拌时间和包合温度对包封率的影响。

图1各因素交互作用的响应面图
Figure1Responsive Surface and contours of the interaction of each factors

图2HP-β-CD、SQ5700、SQ5700与HP-β-CD物理混合物及SQ5700-HP-β-CD包合物的DSC图谱

Figure2DSC spectra of HP-β-CD,SQ5700,HP-β-CD/SQ5700 mixture and HP-β-CD/SQ5700 inclusion complex

可见，SQ5700在210 ℃左右有吸热峰；而HP-β-CD属于无定型粉末，在50～110 ℃有吸热峰，可能是由于HP-β-CD脱水引起的，而HP-β-CD物理混合物的图谱，出现了HP-β-CD与SQ5700吸热峰的简单叠加，在250～300 ℃间出现了多个峰，可能是因为物理混合物中存在着两者之间的物理相互作用的影响，说明物理混合物并不起包合作用。SQ5700-HP-β-CD包合物的图谱表明在实验温度范围内没有任何尖锐峰出现，所有的吸热峰消失，证实了包合物的形成。

2.5.2 红外光谱法

分别称量HP-β-CD、SQ-5700与HP-β-CD物理混合物和SQ5700-HP-β-CD包合物样品适量，在400～4 000 cm-1范围内扫描，用KBr压片绘制红外光谱图[16-17]，结果见图3。

可见，SQ5700在779 cm-1附近有Si-O-C键的弯曲振动，在1 115 cm-1附近处有Si-O键的伸缩振动峰，在2 921、2 851 cm-1处为CH3和CH2的伸缩振动峰等，HP-β-CD的红外光谱都显示糖类的特征吸收峰，1 652 cm-1附近为O-H弯曲振动峰，2 926 cm-1为C-H 伸缩振动，708 cm-1为O-H弯曲振动等，949、854、757 cm-1左右存在葡萄糖环的特征吸收。SQ5700-HP-β-CD物理混合物的红外光谱可以视为二者红外的物理叠加。包合物的红外图谱与HP-β-CD类似，SQ-5700的1 115、2 921、2 851 cm-1吸收峰减弱，HP-β-CD的1 652 cm-1位置的吸收峰消失，因为SQ5700借助氢键等次级键作用包入HP-β-CD空腔中，受其约束，SQ5700相关基团振动消失、减弱，这也从间接验证了包合物的形成。

图3SQ5700(A)、HP-β-CD(B)、SQ5700与HP-β-CD物理混合物(C)及SQ5700-HP-β-CD包合物(D)的红外图谱

Figure3FTIR of SQ5700(A),HP-β-CD(B),HP-β-CD/SQ5700 mixture(C) and SQ5700-HP-β-CD inclusion complex(D)

2.6 包合物的水溶液稳定性考察

精密称取SQ5700-HP-β-CD包合物10 g，置于100 mL容量瓶中，加入去离子水适量进行超声溶解，超声30 min后，取出冷却至室温，继续加入去离子水稀释至刻度线进行定容。分别于1、4、7 d按“2.2”项方法测定其中SQ5700质量分数的变化，重复测定3次，取平均值。结果发现，第1 d到第7 d，SQ5700平均质量分数下降了0.39%，表明通过HP-β-CD的包合可提高SQ5700在水中的稳定性。

3 讨论

SQ5700可与任何比例的水、醇类、酮类、酯类烃类和氯化烃类相混溶，但它在水中容易被水解。本研究曾考察了SQ5700在水、无水乙醇、丙酮的稳定性，结果显示，在室温放置第7 d后，SQ5700的平均质量分数分别下降了5.40%、0.26%、0.43%，表明SQ5700在水中不稳定，而在无水乙醇和丙酮中稳定性良好；另外，SQ-5700可以与丙酮以任意比例互溶，制备的包合物对丙酮的溶解度小，丙酮可以洗脱游离未包封的SQ-5700。因此，本研究采用无水乙醇作为溶剂、丙酮作为洗涤溶剂制备包合物。

HP-β-CD具有内疏水外亲水的性质，本研究中SQ5700为亲水性药物，但其结构中含有长链的烃基这类疏水基团，可通过包合手段进入到环糊精的内部，又因为其化学结构的[R-Si-(OCH3)3]三甲氧基硅具有硅烷的特性，甲氧基(—OCH3)易发生脱甲醇反应(CH3OH)，而形成硅醇基[R-Si-(OH)3]，其多个羟基可与HP-β-CD空穴开口处的羟基形成分子间氢键，使SQ5700和HP-β-CD复合在一起，形成包合物，因此 DSC和红外光谱在包合物中检测不到SQ5700的特征峰。

本研究通过Box-Behnken响应面法优化SQ5700-HP-β-CD包合物的制备工艺，结果表明，经过工艺参数优化后，理论预测的包合物包封率与实测值偏差在5%以内，证明其相关性良好。

对载药包合物稳定性考察结果表明，原料药的质量分数下降5.4%，而包合物的下降0.5%以内，证明包合物可以显著提高药物稳定性。包合物的鉴别方法可以采用多种方法，本文采用DSC法和FTIR法鉴别包合物的形成，对于包合物的理化性质将在后续的工作中进行进一步的研究。