高效液相色谱-串联质谱法测定杂粮豆类中11 种真菌毒素

张新娜，马丽艳,2,*，潘赛超，张春娇，张永新，周 昉，黄昆仑,2，戴蕴青,2

（1.农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（北京），北京 100083；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

真菌毒素是一类由丝状真菌在适宜条件下产生的有毒次级代谢产物[1]，迄今发现已有400多种真菌毒素[2]，是继农药残留、重金属污染后，影响粮食质量安全的又一类关键风险因子。当前发现的主要威胁人类和动物健康的真菌毒素种类有黄曲霉毒素（aflatoxins，AF）、赭曲霉毒素A（ochratoxin，OTA）、伏马毒素（fumonisins，FB）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、HT-2毒素、T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、橘毒素、展青霉素、链格孢霉毒素等[3-4]。大量研究表明，真菌毒素可致DNA损伤，低浓度下即可对人和动物健康造成危害，使肝脏、肾脏和胃肠道发生病变，有些毒素还具有致癌、致畸、致突变等毒性[5-6]。

杂粮豆类是除大豆之外的小宗淀粉质豆类的总称，主要包括绿豆、豌豆、蚕豆、红小豆、扁豆、豇豆、芸豆、鹰嘴豆等[7]。杂粮豆类有一定的营养、保健和药用价值，随着饮食习惯和膳食结构的变化，人们对杂粮豆类的需要越来越多[8]。目前，粮食中真菌毒素的危害已经引起广泛重视，但是对杂粮豆类产品，由于产地分散，产量规模小，其安全问题还未引起足够的重视。但是，已有研究表明，在杂粮豆类的生长过程中易受到豆类根腐病、细菌性叶斑病、灰斑病、锈病、荞麦钩翅蛾等为主的病虫害的危害，从而影响产品产量和质量、埋下食品安全隐患[9]。目前对粮谷的真菌毒素报道很多[10-14]，对豆类的研究主要集中在大豆上，在其他杂粮豆类中的研究较少[15-17]。Castillo等[18]研究发现黑豆可能存在链格孢霉毒素、ZEN和单端孢霉烯族毒素的污染风险。Tseng等[19-20]在白豆中检测到蛇形霉素、ZEN、T-2和FB1、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，赤豆和绿豆中检测到了FB1。Iha等[21]则发现不同加工处理过程可以减少黑白斑豆中OTA的污染水平。

真菌毒素的检测方法主要有薄层色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法等[22-30]。目前国家标准中测定真菌毒素的方法多针对某种或某类毒素，样品的前处理方法多采用固相萃取柱、真菌毒素专用净化柱或免疫亲和柱净化，选择性较强[31-34]。由于真菌毒素的种类较多，且同一样品可能污染多种真菌毒素，建立多种毒素同时测定的方法对于全面掌握真菌毒素的污染状况非常必要。高效液相色谱-质谱联用具有高选择性和灵敏度，可以同时检测多种化合物，在真菌毒素检测中的应用越来越广泛。与常见的小麦、稻谷、玉米等粮谷类样品相比，红豆、绿豆、黑豆等杂粮豆类中在色素、蛋白质、脂肪、碳水化合物等的含量有一定的差异，在质谱中基质对毒素离子化效果会产生一定的影响。因此，本实验针对杂粮豆类中易感染的真菌毒素，通过优化提取溶剂、提取时间、净化方式等，建立高效液相色谱-串联质谱同时检测多种真菌毒素的方法，为更好地监控杂粮豆类中真菌毒素的污染状况、实施质量安全监管、指导消费者安全膳食提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红豆、绿豆和黑豆等样品分别购自北京市、河北省大型连锁超市，以及北京市及河北省县级农贸市场。

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、T-2毒素、DON、FB1、FB2、FB3、ZEN、MycoSep 226多功能净化柱美国Romer公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯） 北京百灵威科技有限公司；C18吸附剂 安捷伦科技（中国）有限公司；Florisil吸附剂 天津博纳艾杰尔科技有限公司；超纯水（Millpore纯水仪制备）。

1.2 仪器与设备

6460高效液相色谱-串联质谱仪 美国安捷伦科技有限公司；涡旋振荡器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；YP5002电子天平 上海越平科学仪器有限公司；HC-3018离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

豆类样品混合均匀，用粉碎机粉碎，过40 目筛。

称取研磨好的样品5.0 g（精确到0.01）于50 mL离心管中，加入15.0 mL甲醇-水（70∶30，V/V），涡旋振荡3 min，在8 000 r/min离心5 min，上清液转移至干净容器中，再次向样品中加入10.0 mL乙腈-水（84∶16，V/V），涡旋振荡3 min，8 000 r/min离心5 min，合并上清液，混匀，取1 mL提取液于2 mL离心管中，加入30 mg C18吸附剂，涡旋30 s后离心，上清液过0.22 μm有机滤膜，待测。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Agilent Proshell 120 EC-C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；流动相：A为0.1%甲酸溶液；B为乙腈；梯度洗脱程序：20% B保持1 min；5 min变为65% B；8 min变为85% B；保持2 min；10.01 min变为20% B保持6 min；柱温30 ℃；流速0.3 mL/min；进样量2.0 µL。

1.3.3 质谱条件

离子源：电喷雾离子源，正负模式切换；检测方式为多反应监测；离子源温度350 ℃；干燥器温度350 ℃；干燥器流速10 L/min；鞘气温度300 ℃；鞘气流速11 L/min；毛细管电压3 500 V；碰撞气为N2。

采用直接进样的方式，将一定浓度的真菌毒素标准溶液注入高效液相色谱-串联质谱中进行质谱条件优化，确定多反应监测参数。

1.4 数据分析

所有实验至少重复3 次，数据以平均值表示，采用Excel 2013软件进行统计分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

分别在正离子和负离子模式下进行母离子扫描，设置扫描范围为200～800 u，确定不同模式下化合物的响应值。确定母离子后，进行子离子扫描，优化碰撞电压。优化结果表明，ZEN在负模式下灵敏度较高，其他化合物在正模式下灵敏度较高，11 种真菌毒素多反应监测质谱参数见表1，11 种真菌毒素基质标准溶液的总离子流图见图1。

表 1 11 种真菌毒素的多反应监测质谱参数Table 1 Multiple reaction monitoring parameters for 11 mycotoxins

图 1 11 种真菌毒素基质标准溶液总离子流图Fig. 1 Total ion current chromatograms of matrix standard solution of 11 mycotoxions

2.2 实验条件优化

2.2.1 提取溶剂优化

实验比较5 种提取溶液的提取效果，提取液分2 次提取，结果见图2。

图 2 溶剂对真菌毒素提取效果的影响Fig. 2 Recovery rates of mycotoxins in different extraction solvents

大多数真菌毒素易溶于有机溶剂。乙腈和甲醇是目前最常用的两种提取溶剂，它们常与一定比例的水组合来提取不同极性的真菌毒素。乙腈-水（84∶16，V/V）是常用的组合，可用于AF、ZEN、DON等毒素的提 取[31,33,35]。 从 图2可 以 看 出 ，利用乙腈-水（84∶16， V/V）提取时，除FB1外，其他真菌毒素的回收率均能达到80%以上，这与B族FB的分子含有羧基基团，极性较强，在该提取溶剂溶解性差有关。在乙腈、甲醇和水3 种溶剂中，极性最大的为水，其次是甲醇，实验发现随着体系中甲醇比例的提高，对FB的提取率逐渐增加，但对其他真菌毒素，特别是AFB1的提取率有所下降。考虑到不同真菌毒素的极性差异，实验采用分步提取的方式进行提取，先用甲醇-水（70∶30，V/V）溶剂体系进行第1次提取，将FB等高极性的化合物提取出来，再用乙腈-水（84∶16，V/V）体系进行第2次提取，将AF等充分提取，从图2可以看出，经过双体系联合提取后，11 种真菌毒素均达到理想的提取效果。

2.2.2 提取时间优化

实验分别比较提取1、2、3、4 min的提取效果，结果表明，提取时间为1 min时DON、FB1、OTA和ZEN的回收率小于60%；提取时间为2 min时，除FB1外，回收率均超过了70%；当提取时间为3 min时，所有真菌毒素的回收率均大于70%，延长提取时间为4 min时，回收率无明显提高，而提取时间的延长可能会使化合物分解或产生变化[13]。因此，实验确定提取时间为3 min。

2.2.3 净化方式优化

在毒素的提取过程中样品中的碳水化合物、蛋白质、脂肪、色素等组分也部分被提取，不仅会影响痕量目标物的检测，也会对色谱、质谱系统造成污染。为降低基质效应，需要对提取液进行净化。MycoSep 226多功能净化柱在多组分真菌毒素的分析中应用较多[35-36]，Florisil和C18吸附剂对脂类、非极性干扰物有一定的吸附作用。实验比较MycoSep 226多功能净化柱、Florisil和C18吸附剂的净化效果。结果发现提取液经MycoSep 226多功能净化柱净化后，FB1和OTA被吸附无法检测到，这与刘丹等[36]的研究一致。提取液中加入30 mg吸附剂净化后，Florisil对FB1有一定的吸附，而C18的净化效果良好，除FB1和ZEN的回收率在80%左右外，其他毒素的回收率均达90%以上，净化后效果良好。Sun Juan等[37]在研究谷物中多种毒素的提取方法时也发现C18吸附剂净化后，大多数真菌毒素的回收率为60.0%～101.7%，结果较为满意。实验发现随着C18吸附剂加入量的增加，也会对FB1和ZEN有一定的吸附，因此本实验采取30 mg C18进行净化处理。

2.2.4 线性关系、检出限和定量限测定

分别吸取不同浓度的真菌毒素标准溶液，用空白基质配制标准曲线，按建立好的方法进行质谱分析，以质量浓度为横坐标，定量离子的响应值为纵坐标绘制标准曲线，以3 倍信噪比计算方法的检出限。标准溶液的线性范围、相关系数及检出限见表2。

表 2 11 种真菌毒素的线性范围、相关系数和检出限Table 2 Linear ranges, correlation coefficients (r) and LODs of 11 mycotoxins

从表2可以看出，不同真菌毒素标准曲线的质量浓度范围有一定差异，主要考虑了真菌毒素的限量水平、仪器的响应值、实际阳性样品的含量范围等因素。11 种真菌毒素在各种范围内线性关系良好，相关系数在0.999 0～0.999 9之间。GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》中规定了食品中6 种真菌毒素的限量，其中涉及豆类及其制品有AFB1和OTA，其限量均为5 μg/kg；涉及谷物及其制品中有DON和ZEN，限量分别为1 000 μg/kg和60 μg/kg，目前尚未对FB和T-2毒素制定限量标准。欧盟对直接食用的玉米中FB的限量为1 000 μg/kg；对其他谷物中T-2的限量为50 μg/kg[38]，从已有的限量看，本实验建立的方法能满足食品中真菌毒素残留限量的测定要求。

2.2.5 方法的准确度和精密度

采用添加回收的方法测定方法的准确度。分别向空白样品中添加不同浓度的真菌毒素标准溶液，按确定好的方法提取、净化、分析，加标回收率实验结果见表3。

表 3 11 种真菌毒素的加标回收率（n= 6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 11 mycotoxins from spiked samples (n= 6)

从表3可以看出，11 种真菌毒素在2.50、5.00、25.0 μg/kg三个添加水平的回收率在70.0%～108%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在1.3%～8.6%之间，符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范基本信息 食品理化检测》中的相关要求。

2.2.6 杂粮豆类中真菌毒素的检测

利用建立的方法对黑豆（12 份）、绿豆（13 份）、红豆（12 份）共37 份样品进行检测，结果发现6 份样品中检出真菌毒素，阳性率为16.2%，所检测到的真菌毒素均为ZEN残留，其中绿豆样品2 份、红豆样品4 份。

绿豆样品中ZEN检出阳性率为15.4%，平均含量3.4 μg/kg，该含量均低于谷物及其制品中规定的ZEN的限量值。红豆样品中ZEN检出阳性率为33.3%，其中有两份样品含量较高，分别为270 μg/kg和764 μg/kg，超过国家标准中ZEN的限量值（60 μg/kg）4～12 倍，应当引起注意。

3 结 论

本实验建立甲醇-水（70∶30，V/V）、乙腈-水（84∶16，V/V）两种溶剂体系联合提取，C18吸附剂净化，高效液相色谱-串联质谱同时检测杂粮豆类中的11 种真菌毒素的方法。该方法简单、快速、准确度高可用于真菌毒素的快速检测。对杂粮豆类中真菌毒素检测结果表明，该类食品中存在一定的安全隐患，希望相关部门给予重视、进行风险评估，制定相应的政策和措施，以保障餐桌上的食品安全。