基于滋味成分HPLC指纹图谱的判别分析及相似度评价在信阳毛尖茶分等定级中的应用

王淑慧，宋沙沙，曹学丽*

（北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京工商大学食品学院，北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048）

中国是茶叶的发源地，栽培历史悠久，种植幅员辽阔，种类繁多，制法工艺不断推陈出新。信阳毛尖茶是中国的十大名茶之一，属炒青绿茶[1]。其外形细、圆、光、直，锋苗挺秀，色泽翠绿光润，白毫显露；内质汤色嫩绿明亮，香气鲜浓持久，有熟板栗香，滋味鲜浓、爽口、回甘生津，叶底嫩绿明亮、匀整[2]。目前，对茶叶分等定级的方法以感官评审为主[3]，该方法依赖评茶师的评茶经验，存在很大的主观性，使茶叶的等级标准不统一，市面上的茶叶品质鱼龙混杂。因此，研究茶叶品质的科学评定方法和质量监测体系，对于促进茶叶产业的健康持续发展具有重大意义。

茶汤中的主要化学成分有多酚、咖啡碱、茶多糖、茶氨酸、碳水化合物和维生素等[4]，对茶叶的品质[5-6]和滋味[7-11]具有重要贡献。在感官评审中，茶汤滋味对茶叶感官评审的贡献率达30%～35%，占最主要位置[3]。因此，茶叶滋味的研究具有重大意义。指纹图谱技术主要应用于鉴别中药的真伪和质量控制等[12-14]，近年来被应用到茶叶的质量控制中[15-16]。本研究将指纹图谱技术用于茶叶分等定级和质量控制中，以信阳毛尖为研究对象，采用高效液相色谱（high performance liqulid chromatography，HPLC）技术，通过建立信阳毛尖茶滋味成分HPLC指纹图谱，对茶汤滋味成分进行分析，将判别分析法与指纹图谱相似度法相结合，用于确定不同等级茶样之间的差异性，为绿茶客观品质评价和质量监控建立一种科学量化的方法。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

供试茶样为2014年4—5月的信阳毛尖茶，均来自信阳市文新茶叶有限责任公司，包括优质信阳毛尖茶“道”系列4 个等级多个批次的22 个茶样，按等级从高到低依次为观道（5 个批次）、悟道（5 个批次）、修道（6 个批次）和品道（6 个批次）；普通信阳毛尖茶“300”系列3 个等级多个批次的19 个茶样，按等级从高到低依次为330（6 个批次）、320（7 个批次）和310（6 个批次）。用复合铝箔袋密封样品，保存于4 ℃冰箱中，冷藏待用。

样品的等级评定由具有资质的品茶师按照GB/T 22737—2008《地理标志产品 信阳毛尖茶》[17]中对不同级别信阳毛尖茶的文字标准，结合GB/T 23776—2009《茶叶感官审评方法》[3]完成。样品的分析工作于2014年底完成。

乙腈（色谱级） 美国Fisher科学公司；磷酸（色谱级） 天津光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

1260 HPLC仪（配有四元梯度泵、自动进样器、二极管阵列检测器、Chem Station色谱工作站等）美国Agilent公司；Atlantis T3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱 美国Waters公司；150 mL专业茶叶审评杯 景德镇陶瓷。

1.3 方法

1.3.1 茶汤制备

茶汤的制备按照GB/T 23776—2009[3]冲泡绿茶的程序进行：称量3 g绿茶样品于150 mL评茶杯中，倒入150 mL沸水，盖上杯盖冲泡5 min后，将茶汤滤出，待茶汤的温度降低后，取一定量的茶汤过0.22 μm滤膜，进行HPLC分析。

1.3.2 茶汤滋味指纹图谱建立

分别称取各批次信阳毛尖样品5 份，按照1.3.1节方法进行茶汤制备。根据本实验室的前期研究[18]，采用HPLC分析方法：色谱柱：Waters-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.04%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～60 min，4%～25% B；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；检测波长：210 nm。每份信阳毛尖茶样品均做3 针平行实验。将所获得的同一等级的液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版本），生成相应等级茶叶的HPLC指纹图谱。

1.3.3 茶样判别分析

分别以2 个系列信阳毛尖为研究对象，采用判别分析法进行等级判别。根据前期研究成果[18]，筛选15 种共有特征滋味成分，如表1所示。将所得到的每个样品色谱图中含量最高的共有峰峰面积为参照，计算其他共有峰相对峰面积，以相对峰面积作为原始数据，采用SPSS 20.0软件，采用输入自变量方法中的Wilks λ法进行判别分析，建立判别方程，验证判别方程对初识分组的分类结果[19-21]。

表 1 信阳毛尖茶汤15 种特征滋味成分Table 1 Fifteen characteristic flavor compounds in Xinyang Maojian tea infusion

1.3.4 指纹图谱相似度计算

同种绿茶的分等定级属于小类水平上的区别，所以选择适合同种绿茶不同等级的相似度计算方法是体现差异的关键。综合考虑文献中多种相似度计算方法后，选择夹角余弦法、相关系数法、新模型负指数法、改进Nei系数法、改良程度相似度、新改良程度相似度、Manhattan距离系数法7 种计算方法进行同种绿茶不同等级之间相似度计算。当两图谱的相对差异越小时，相似度系数的取值越接近于1，距离系数越小，即茶叶等级间的差异越小。

以优质信阳毛尖“道”和普通信阳毛尖“300”系列7 个等级多个批次样品15 个特征滋味成分的HPLC平均峰面积为计算参数，利用Excel软件的数据处理功能，以最高级别观道茶样指纹图谱为计算参照，将各级计算得到的各特征峰的平均峰面积分别代入7 种相似度计算方法的公式中，得到各等级与最高级别的相似度。

1.3.4.1 夹角余弦法

夹角余弦系数法[22]是将两系统A和B的信息转化为两向量的相互关系，所以系统在质上和量上的区别分别对应于向量中的方向和模长。两向量的夹角余弦见公式（1）：

式中：ai为系统A的第i个共有色谱峰的峰面积；bi为系统B的第i个共有峰的峰面积；n为系统中共有峰的个数。

1.3.4.2 相关系数法

相关系数法也称为皮尔逊相关系数法[23]，是中心化了的夹角余弦，用于测试变量之间的相关性，是形状测度，与夹角余弦法在本质上一样。相关系数法计算见公式（2）：

式中：a为系统A的所有共有峰峰面积的平均值；b为系统B的所有共有峰峰面积的平均值。

1.3.4.3 新模型负指数法

新模型负指数方法[24]原理借鉴向量夹角法的基本思路，某物质在两图谱的相对差异为A图谱中该物质峰面积减去B图谱中该物质峰面积的值与B图谱该物质峰面积的比值；图谱相似度的指标参数为图谱整体平均相对差异的负指数。新模型负指数法计算见式（3）：

1.3.4.4 改进Nei系数法

改进Nei系数法[25]是对峰重叠率法[26]的改进，原理是在保证两色谱具有相同的色谱峰数目的前提下（无峰的对应位置记为0），按照峰在谱图上的保留时间进行排序，建立峰序号与其峰面积坐标系，将每个系统的色谱点描成折线，成为色谱指纹特征曲线，将相比较的两系统色谱指纹图谱相似度记为两色谱指纹特征曲线的重合率。计算见公式（4）：

式中：n1、n2分别为两图谱的总峰数；n为共有峰数。

1.3.4.5 改良程度相似度法

改良程度相似度法[27]是对程度相似度法[28]的改进。程度相似度为各相似要素相似倍数的平均值，在实际应用中，由于每个相似要素差异情况各不相同，因此对程度相似度的结果也会存在程度大小不同的影响。孟庆华等[25]在此基础上进行改进，并进行实际应用，其计算见式（5）：1.3.4.6 新改良程度相似度法

詹雪艳等[29]在改良程度相似度的基础上，指出改良程度相似度不能反映差异分布不同的两样本的相似度，提出新的计算方法见公式（6）：1.3.4.7 Manhattan距离系数法

距离系数体现的是总峰面积的差异或者总峰面积的平均差异，代表绝对距离上的差异大小，距离越大，两者的差异越大，但是不能衡量相似关系远近的程度。距离系数在色谱指纹图谱中的应用，通常是以共有峰为计算对象，初步衡量样本在量上的差异[30]，其计算见公式（7）：

2 结果与分析

2.1 信阳毛尖茶HPLC指纹图谱的建立

图 1 “道”系列4 个等级信阳毛尖茶HPLC指纹图谱Fig. 1 HPLC fingerprints of four grades of the “Dao” series of Xinyang Maojian tea

图 2 “300”系列3 个等级信阳毛尖茶HPLC指纹图谱Fig. 2 HPLC fingerprints of three grades of the “300” series of Xinyang Maojian tea

从图1、2可以看出，优质“道”系列在滋味物质含量上要高于普通“300”系列，但“道”系列4 个等级间及“300”系列3 个等级间的差异并不能明显看出。2 个系列7 个等级的信阳毛尖茶汤15 种特征滋味成分的含量见表2。

2.2 基于滋味特征成分的信阳毛尖茶等级判别分析

以信阳毛尖茶“道”系列4 个等级22 个样品和“300”系列3 个等级19 个样品的15 个共有峰的相对峰面积为原始数据，采用SPSS 20.0 建立典型判别函数，该方法对初始等级样本中的95.1%进行正确分类。从图3可知，7 个不同等级的信阳毛尖茶之间差异显著，且普通信阳毛尖“300”系列和优质信阳毛尖“道”系列之间具有显著差异，区分度也很好，实现对同一品种不同等级信阳毛尖茶的等级区分。表明利用茶汤滋味特征成分可以对普通和优质信阳毛尖进行很好的等级判别分析，且差异显著。

表 2 信阳毛尖2 个系列7 个等级茶的15 个特征滋味成分含量（以峰面积计）Table 2 Peak area of 15 characteristic flavor components in seven grades of two series of Xinyang Maojian tea

图 3 基于HPLC指纹图谱的信阳毛尖茶“道”系列和“300”系列判别分析Fig. 3 Discriminant classification of two series of Xinyang Maojian tea based on HPLC fingerprints

分别以信阳毛尖茶“道”系列22 个样品和“300”系列19 个样品按相同方法分别进行判别分析，对初始分组样品中的100%进行正确分类。从图4可以看出，“道”系列4 个等级之间具有显著差异，区分度更好。从图5可以看出，“300”系列3 个等级之间也具有显著差异，区分度也很好。表明采用滋味特征成分可以对优质信阳毛尖不同等级进行很好的等级判别。

图 4 基于HPLC指纹图谱的信阳毛尖茶“道”系列4 个等级判别分析Fig. 4 Discriminant classification of four grades of the “Dao” series of Xinyang Maojian tea based on HPLC fingerprints

图 5 基于HPLC指纹图谱的信阳毛尖茶“300”系列3 个等级判别分析Fig. 5 The discriminant classification of three grades of the “300”series of Xinyang Maojian tea based on HPLC fingerprints

2.3 不同等级信阳毛尖茶的HPLC指纹图谱相似度评价

以最高级别观道茶样指纹图谱为参照，计算得到的7 种相似度计算结果如表3所示。除距离系数法外，6 种相似度计算法对信阳毛尖茶不同等级茶叶的区分度从夹角余弦法、相关系数法、改进Nei系数法、新模型负指数、改良程度相似度法、新改良程度相似度法依次提高，新改良程度相似度法能最大程度地反映出不同等级信阳毛尖之间的差距，且普通“300”与优质“道”系列间相似度较低，差异较大，可见“300”系列茶叶级别较低。采用该方法对茶叶进行分等定级与市面等级相一致，且能计算出各等级间的差异大小，表明采用指纹图谱相似度计算的方法能对茶叶进行分等定级。

表 3 信阳毛尖茶“道”和“300”系列HPLC指纹图谱相似度计算Table 3 Similarity calculation of HPLC fingerprints for the “Dao” and“300” series of Xinyang Maojian tea

若仅对“道”系列4 个等级的数据进行分析，仍是新改良程度相似度法最能反映等级之间的差异程度。观道与悟、修、品道间差异显著，悟道与修道接近，它们与品道间的差异较小，但与实际的等级相一致。表明采用指纹图谱相似度的方法能对优质信阳毛尖茶进行分等定级。

若对“300”系列3 个等级的数据进行单独处理，以最高级别330指纹图谱为计算参照，按上述相同的方法计算相似度，结果如表4所示，也是新改良程度相似度法最能反映等级之间的差异程度，3 个等级茶叶间的差异较小，但也能明显区分，且与实际等级相一致。表明采用指纹图谱相似度的方法能对普通信阳毛尖茶也能进行分等定级。

表 4 信阳毛尖茶“300”系列HPLC指纹图谱相似度Table 4 Similarity calculation of HPLC fingerprints for the “300”series of Xinyang Maojian tea

3 结 论

采用HPLC方法分别建立信阳毛尖“道”系列和“300”系列共7 个等级茶叶滋味成分HPLC指纹图谱，但同品种不同等级茶叶间的差异很难从其指纹图谱中直接看出。因而本实验首先基于15 种滋味特征成分，采用判别分析法对2 个系列7 个等级41 个样品进行判别分析，其等级区分正确率为95.1%，分别对2 个系列的茶样进行判别分析，正确率则近100%，表明该方法能够对同品种茶叶进行很好的等级区分判别。采用7 种指纹图谱相似度计算方法对各等级茶叶间的相似度进行计算，结果显示，各相似度计算方法均能在一定程度上反映茶叶等级间的差异大小，其中以新改良程度相似度法最佳，采用该方法对茶叶分等定级结果与其实际等级相一致，且可以实现对各等级间的差异量化，表明可以将所建立的指纹图谱相似度计算方法应用于同品种不同等级绿茶的分等定级中。

对未知样品的分级要通过先建立其HPLC指纹图谱，采用上述方法，尤其是新改良程度相似度计算方法，与信阳毛尖茶标准样品的指纹图谱进行相似度对比，确定未知茶样的等级。该结果可为茶叶分等定级提供理论研究支持和方向。