整合素连接激酶在缺氧晶状体上皮细胞中的表达变化及其对细胞上皮-间充质转化的影响

朱艳，朱玉广，曹智，滕兴波，孙海霞，刘宪金，杨伟舟

(潍坊医学院附属医院，山东潍坊261053)

后囊膜混浊(PCO)是现代白内障手术后常见的并发症之一，影响患者视功能恢复，可造成严重的视力损害[1]。白内障手术后残存的晶状体上皮细胞(HLECs)发生上皮-间充质转化(EMT)是PCO形成的病理基础[2]。整合素连接激酶(ILK)是一种丝氨酸/苏氨酸细胞内蛋白激酶，ILK参与整合素、缺氧诱导因子1(HIF-1)等多条细胞内外信号转导通路，ILK活化后可调节细胞凋亡、黏附、增殖、分化及血管生成等多种生物学过程[3～5]。另外，ILK也是一种低氧反应因子，在细胞缺氧时表达增高[6,7]。本课题组前期研究发现，ILK参与TGF-β2诱导的HLECs EMT[8]。最近研究表明，缺氧可诱导HLECs发生EMT[9]。然而，对于缺氧条件下ILK是否参与HLECs的EMT目前尚不清楚。2018年1～6月，本研究建立HLECs缺氧模型，观察ILK在缺氧HLECs中的表达变化及其对细胞EMT的影响，从新的视角探索HLECs EMT早期发生机制，寻找早期干预EMT的有效方法。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要实验材料 人永生化晶状体上皮细胞HLEC-B3(美国ATCC公司)，兔抗人ILK单克隆抗体、兔抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体(美国Sigma公司)，兔抗人纤维连接蛋白(FN)单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，羊抗兔IgG(美国Abcam公司)，DMEM细胞培养液、胎牛血清(美国GIBCO公司)，CoCl2(美国Sigma公司)，TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)，ILK抑制剂QLT0267(加拿大QLT公司)，PCR引物(上海生工公司)。

1.2 HLECs缺氧模型构建及ILK检测 取液氮保存的HLEC-B3细胞系，在37 ℃水浴箱中快速解冻，细胞悬液转移到离心管，滴加DMEM培养液，吹打混匀后离心，弃上清液，加入含双抗抗生素的DMEM培养液(20%胎牛血清)，吹打混匀，在37 ℃、5% CO2培养箱中单层贴壁培养。每3～4 d换DMEM培养液1次，胰蛋白酶消化传代。取处于对数生长期的HLECs，胰蛋白酶消化，以10×106/L接种于96孔板，每孔100 μL，继续培养24 h后去培养液，分别加入0、25、50、100、200、400 μmol/L的CoCl2，每个CoCl2浓度设置3个复孔。在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h后，采用CCK-8法测算细胞存活率，最终选择100 μmol/L的CoCl2进入下一步实验。在HLECs培养瓶中加入含100 μmol/L CoCl2的DMEM培养液分别培养0、6、12、24、48 h后收集细胞，细胞裂解法提取总蛋白，BCA法测定样本蛋白浓度并配平，取变性蛋白20 g/孔加入凝胶加样孔进行电泳，转PVDF膜，脱脂奶粉封闭；TBST 37 ℃封闭1 h，加入相应一抗(兔抗人ILK单克隆抗体,1∶500)4 ℃孵育过夜；次日TBST洗膜，加二抗IgG(1∶1 000)室温孵育2 h;TBST洗膜，按照ECL试剂盒说明操作，室温下曝光、显影并定影；采用UVP凝胶成像系统分析目的蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，以目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。

1.3 ILK表达变化对缺氧HLECs中EMT相关蛋白表达的影响观察

1.3.1 HLECs分组及处理 将HLECs分为CoCl2组、ILK抑制剂组、对照组。CoCl2组加入含100 μmol/L CoCl2的培养基；ILK抑制剂组用ILK特异性抑制剂QLT0267(10 nmol/L)预处理1 h后，再加入含100 μmol/L CoCl2的培养基；对照组加入无血清培养基。三组继续培养24 h后，进行后续实验。

1.3.2 α-SMA、FN蛋白检测 采用Western blotting法检测三组细胞中的α-SMA、FN蛋白。具体方法参考“1.2”。

1.3.3 α-SMA、FN mRNA检测 收集三组细胞，TRIzol提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度。将RNA逆转录成cDNA，进行荧光定量PCR反应，以人β-actin基因作为内参。α-SMA基因上游引物序列为5′-CTGACAGAGGCACCACTGAA-3′，下游引物序列为5′-CATCTCCAGAGTCCAGCACA-3′。FN基因上游引物序列为5′-GAGAATAAGCTGTACCATCGCAA-3′，下游引物序列为GGGCGAGTAGGAGCAGTTG-3′。人β-actin基因上游引物序列为5′-CTTACAGATCATGTTTGAGACCTTCAA-3′，下游引物序列为5′-CTCAGGGCAGCGGAACC-3′。反应条件为93 ℃ 3 min；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共40个循环。测得目的基因和β-actin基因的循环阈值，根据标准曲线换算目的基因与β-actin基因的拷贝数，以二者比值表示目的基因的相对表达量。

2 结果

2.1 不同缺氧时间HLECs中ILK蛋白表达变化 缺氧0、6、12、24、48 h时HLECs中ILK蛋白相对表达量分别为0.382±0.018、0.515±0.023、0.807±0.044、0.951±0.048、0.256±0.019。缺氧6、12、24、48 h时ILK蛋白相对表达量均增高，其中缺氧12、24 h时ILK蛋白相对表达量高于缺氧6、48 h时(P均<0.05)。见图1。

图1 缺氧不同时间HLECs中ILK蛋白表达情况(Western blotting法)

2.2 各组HLECs中α-SMA、FN蛋白表达比较 CoCl2组、ILK抑制剂组及对照组α-SMA蛋白相对表达量分别为0.671±0.032、0.428±0.025、0.091±0.014；FN蛋白相对表达量分别为1.125±0.133、0.420±0.029、0.136±0.012。CoCl2组细胞中α-SMA、FN蛋白相对表达量高于对照组，ILK抑制剂组细胞中α-SMA、FN蛋白相对表达量低于CoCl2组(P均<0.01)。见图2。

注：1为CoCl2组；2为ILK抑制剂组；3为对照组。

2.3 各组HLECs中α-SMA、FN mRNA表达比较 CoCl2组、ILK抑制剂组及对照组α-SMA mRNA相对表达量分别为1.851±0.038、0.672±0.019、0.053±0.013；FN mRNA相对表达量分别为2.036±0.042、0.892±0.027、0.157±0.016。CoCl2组细胞中α-SMA、FN mRNA相对表达量高于对照组，ILK抑制剂组细胞中α-SMA、FN mRNA相对表达量低于CoCl2组(P均<0.01)。

3 讨论

白内障是我国最常见的致盲性眼病，目前治疗白内障的手术方案为超声乳化术联合后房人工晶体植入[10]。白内障术后PCO影响部分患者视功能的恢复。对于高端人工晶体植入术，PCO是白内障术后视觉干扰的主要因素之一[11,12]。白内障手术过程中保留了晶状体囊袋，囊内残存的HLECs增生、分化是手术后PCO发生的主要原因[2]，HLECs的EMT是PCO形成的主要病理基础。

ILK是一种与细胞外基质及细胞信号通道有关的丝氨酸/苏氨酸细胞内蛋白激酶，与细胞内多种活性蛋白关系密切。ILK参与整合素、HIF-1等多条细胞内外信号转导通路。ILK活化后对下游的效应蛋白进行磷酸化从而发挥效应，参与细胞的生长、分化、迁移和肿瘤生成等过程[3]。同时，ILK也是一种低氧反应性因子，低氧可诱导ILK表达，激活多条与低氧应激等有关的信号通路，影响细胞多种生物学功能[6]。

不同于人体内的其他细胞，晶状体及其上皮细胞存在于缺氧环境中[13]。建立HLECs缺氧模型可模拟体内HLECs的微环境[9,14]。CoCl2通过其CO2+替代血红素的Fe2+与氧进行结合，使干预细胞处在缺氧状态。在常氧状态下，CoCl2还可激活细胞内HIF-1α诱导的信号通路，发挥类似缺氧的效应[15]。因而CoCl2常被用于制备细胞缺氧模型。本研究选择100 μmol/L的CoCl2作用于HLECs，成功制作了HLECs缺氧模型。检测不同缺氧时间HLECs中的ILK，结果发现，在缺氧6 h时ILK表达明显升高，随缺氧时间延长，ILK表达逐渐增强并在缺氧24 h时达到最高，缺氧48 h时ILK表达下降。以上结果说明短时间的缺氧可诱导ILK表达增加，长时间缺氧可造成HLECs的损伤，使ILK表达下降，据此我们选择缺氧24 h的HLECs进行后续实验。

为了观察ILK的表达变化对HLECs EMT的影响，我们选择ILK特异性抑制剂QLT0267进行进一步的研究[16]。本研究结果显示，与对照组比较，CoCl2组α-SMA、FN蛋白及其mRNA的表达均明显增强；与CoCl2组比较，ILK抑制剂组α-SMA、FN蛋白及其mRNA的表达明显减弱。这提示QLT0267通过特异性抑制ILK，抑制了HLECs中EMT早期标志蛋白的表达，影响了EMT过程，从另一方面证实ILK在缺氧诱导的HLECs EMT中发挥重要作用。同前期研究[8]结果类似，QLT0267也部分抑制了CoCl2诱导的HLECs EMT，但并没有全部阻断EMT过程，说明可能有其他通路参与了CoCl2诱导的HLECs EMT过程。我们认为，在HLECs EMT过程中，可能存在复杂的细胞信号调控通路，而ILK及其信号通路可能只是其中的一个关键节点。

在很多细胞系或肿瘤细胞中，缺氧可同时诱导ILK和HIF-1α的表达，参与细胞EMT或肿瘤进展。在某些细胞中，ILK可调控HIF-1α的表达[17,18]。而在少数细胞中，HIF-1α可以调控ILK的表达[19]。推测可能存在ILK-HIF-1α调节反馈回路[20]，在缺氧期间维持高水平的HIF-1α表达。缺氧不仅可以诱导HLECs中ILK的表达，同样可以激活HIF-1。对于HLECs中ILK与HIF-1的调控关系尚未见报道，这需要我们进一步深入研究，以阐明HLECs EMT的分子机制，干预HLECs EMT，预防PCO的发生。