布鲁氏菌病温敏凝胶活疫苗(S2株)对小鼠不同黏膜免疫途径的免疫效果研究

刘 燕，徐 磊，王 蕾，张 贺，王 楠，鞠洪涛，张小军，王苗苗，孙浩杰，丁家波，沈国顺，毛开荣*

(1.沈阳农业大学，辽宁 沈阳 110866；2.中国兽医药品监察所，北京 100081；3.齐鲁动物保健品有限公司，山东 济南 250105)

布鲁氏菌病(Brucellosis)，是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患病。不仅给畜牧业带来严重损失，同时威胁人类健康和公共卫生安全[1]。我国已将布鲁氏菌病列为二类动物疫病，并且列入《 国家中长期动物疫病防治规划(2012～2020)》重点防控疫病目录。家畜布鲁氏菌病防控的主要措施是扑杀净化与免疫，而我国目前免疫是防控布鲁氏菌病的主要手段。国内外用于动物防控的布鲁氏菌病弱毒活疫苗菌株主要包括：牛种布鲁氏菌S19(A19)、羊种布鲁氏菌 M5、Rev.1、猪种布鲁氏菌 S2[2]。这些疫苗中，除S2 主要通过口腔黏膜免疫外，其它则主要采用注射免疫，后者会导致孕畜流产，因此黏膜免疫更适合临床应用。布鲁氏菌病活疫苗(S2 株)通过口腔黏膜免疫，其抗体最多只维持6 个月左右，相对注射免疫抗体可能长达18 个月来说，口腔黏膜免疫有利于鉴别疫苗免疫和自然感染。

温敏凝胶是指以溶液状态给药后，利用高分子材料对外界温度的响应发生相转变的特性，由液态转化为非化学交联半固体凝胶的制剂[3]。将温敏凝胶与药物结合，通过给药部位由液态转变成半固态，可达到固定药物减少流失的作用，并且起到缓慢释放药物的效果[4-5]。采用温敏凝胶搭载流感病毒[6]、球虫[7]、口蹄疫多肽[8]、防龋基因疫苗[9]、蛋白[10]等均有报道。将布鲁氏菌病疫苗制备成温敏凝胶剂型，有助于减少疫苗流失，增加生物利用度并减少因黏膜免疫时疫苗向体外扩散带来的生物安全问题。

为评价凝胶剂型的布鲁氏菌病疫苗经口服、点眼、阴道和直肠灌注4 个黏膜途径的免疫效果，本研究采用国际认可的评价布鲁氏菌病疫苗的小鼠动物模型，比较了温敏凝胶剂型疫苗、常规剂型疫苗经4 个黏膜途径免疫及常规剂型疫苗经皮下注射免疫的效果，进一步证实上述4 个黏膜途径均有良好的免疫效果，并且温敏凝胶剂型具有明显减少疫苗黏膜免疫时对环境的扩散作用。

1 材料与方法

1.1 菌株与实验动物 布鲁氏菌病活疫苗(S2 株)和布鲁氏菌强毒株M28 均由国家布鲁氏菌病参考实验室保存；100只18g～21g的BALB/c小鼠(6周龄～8周龄)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要试剂和仪器 泊洛沙姆407 (P407)、泊洛沙姆 188 (P188)购自 BASF 公司；布鲁氏菌选择性培养基添加剂购自上海艾研生物科技有限公司；布鲁氏菌病试管凝集抗原、布鲁氏菌病标准阳性血清、布鲁氏菌病标准阴性血清均由国家布鲁氏菌病参考实验室保存；Rhwolaser Mastertm 微流变仪购自法国formulaction 公司。

1.3 黏膜免疫用温敏凝胶疫苗的研制 使用温度计和非接触式电子体温计测定小鼠眼部、口腔、阴道、直肠的温度(实验小鼠在整个试验过程中环境温度恒定，因此不考虑环境温度对免疫部位温度的影响)，测定后对结果进行统计，选择合适的凝胶相变温度范围。根据该凝胶相变温度范围设定4 个配方，按量分别称取P407 和 P188，缓慢加入生理盐水，轻轻摇晃，4 ℃放置 18 h～24 h，充分溶胀后即为温敏凝胶，121 ℃ 30 min 高压灭菌后4 ℃保存温敏凝胶。将 S2 疫苗和凝胶按体积比 1∶9 混合，即得布鲁氏菌病温度敏感凝胶疫苗。取4 个配方的温敏凝胶疫苗各10 mL 加到Rheolaser MASTERTM微流变仪样品池中，20 ℃平衡10 min，设定温度升高范围 20 ℃～50 ℃，升温速率为 0.5 ℃/min，启动程序对样品进行扫描，获得样品的相变温度及理化性质。

1.4 实验设计 将实验小鼠分别按照点眼(A组)、口服(B组)、阴道灌注(C组)、直肠灌注(D组)、皮下注射(E组) 5 种不同免疫途径设定实验组，同时设对照组(F组)，每组 20 只。另 A、B、C、D 黏膜途径免疫组均分别设凝胶疫苗免疫实验组和常规疫苗免疫对照组，每组 10 只。免疫 45 d 后，以 5×105cfu/ 只(布鲁氏菌M28)肌肉注射攻毒全部小鼠。

1.5 小鼠免疫部位的排菌量测定 各组小鼠免疫后30 min、3 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d，采用棉签擦拭点眼、阴道灌注、口服、直肠灌注免疫部位的小鼠体表，再涂布于布鲁氏菌选择性培养基培养皿，37 ℃培养72 h 后，观察并统计布鲁氏菌菌落数。

1.6 小鼠体液免疫水平测定 小鼠免疫后21 d、45 d (攻毒)、66 d、90 d 时，经小鼠眼眶静脉丛分别采集各组小鼠血液(100 μL/ 只)，分离血清，采用微量试管凝集试验(MSAT)测定小鼠血清抗体效价(血清初始稀释度为 1∶2)。

1.7 不同免疫途径对小鼠免疫效力的测定 小鼠免疫后90 d (攻毒后45 d)，迫杀各组小鼠，无菌采集其脾脏，放入灭菌带有钢珠的离心管中，加入1 mL蛋白胨水，置高通量组织研磨仪中振荡10 min，取浆液梯度稀释成 100 倍和 10 000 倍。将原倍、100倍、10 000 倍稀释液各取 300 μL 分别涂布 3 个布鲁氏菌选择性培养皿，37 ℃培养72 h，根据生长菌落数计算小鼠的脾载菌量，参照OIE 保护率计算方法[11]计算疫苗的单位保护UP (UP= 对照出菌指数- 免疫出菌指数)，比较不同途径的免疫效力。

2 结 果

2.1 温敏凝胶疫苗的制备 对30 只小鼠的口腔、眼部、阴道、直肠部位测定温度后统计结果，见表1。根据小鼠免疫部位的温度，温敏凝胶相变温度选定范围为34 ℃～36 ℃。

表1 小鼠免疫部位温度测定结果Table 1 The temperature of the immune site

根据该温度范围确定凝胶疫苗的配方，并测定4 个凝胶配方的相转变温度，计算偏差并进行分析，各配方的T 偏差的绝对值均小于5 % (表2)。

表2 凝胶疫苗4个配方的相转变温度Table 2 Optimization results of selected formulations

测定了4个疫苗配方形成凝胶过程的固液平衡点 (Solid～liquid balance, SLB)、宏 观粘度分子(Macroscopic viscosity index, MVI)、和流动因子(Fluidity index, FI)这3个主要相变 因子(图1)。结果显示，3 号配方形成凝胶时间最短，为最优配方，根据此结果制备温敏凝胶疫苗。

2.2 小鼠免疫部位排菌量测定 各种黏膜途径免疫小鼠后分别检测各组排菌量及排菌时间，结果显示，从疫苗剂型分析，凝胶剂型疫苗在第2 d 基本停止排菌，而作为对照的常规疫苗排菌持续了4 d；从同时间的排菌量相比，凝胶剂型疫苗只有常规剂型疫苗的0～30 %。从免疫部位分析，阴道灌注(B组)小鼠排菌量最低(低于100 cfu)，且排菌时间最短(1 d 以内)，眼部滴注(A组)与直肠灌注(D组)次之，而口服(C组)小鼠排菌量明显大，排菌时间明显长(图2)。结果表明凝胶剂型疫苗相比较常规疫苗在免疫后能够在一定程度上限制免疫部位的排菌，且阴道粘膜免疫途径排菌量最低。

2.3 小鼠抗体消长规律测定 各组小鼠免疫后采用MSAT 检测其抗体水平，结果显示，注射免疫后的抗体滴度显著高于黏膜免疫，并且持续时间更长，提示注射对体液免疫的刺激显著高于黏膜免疫。在4 种黏膜免疫途径中，点眼和口服免疫后的小鼠抗体水平最低(最高1∶50)，直肠和阴道灌注免疫后的小鼠抗体最高水平显著高于点眼和口服，但在免疫后45 d 左右就降至1∶50。抗体消长规律结果显示，各途径免疫小鼠后抗体水平均在免疫后20 d 左右达到峰值，4 种黏膜免疫小鼠的抗体水平均在45 d 左右低于或接近1∶50，而此时注射免疫后的抗体仍显著高于1∶50。在攻毒后，所有黏膜途径免疫小鼠抗体水平均显著提高，并且在攻毒后20 d 左右到达峰值，之后快速下降，而注射免疫小鼠则受攻毒影响较小，抗体呈现20 d 左右的维持状态，之后缓慢下降(图3)。表明黏膜免疫后抗体持续时间短，有利于鉴别诊断。

图1 4个疫苗配方形成凝胶过程的固液平衡点(A)，宏观粘度分子(B)流动因子(C)曲线图Fig.1 The SLB(A), MVI(B) and FI(C) curve of four recipes

图2 不同免疫方式的小鼠免疫部位排菌情况Fig.2 The status of bacterial shedding in different immune modes

图3 布鲁氏菌病活疫苗(S2 株)黏膜和注射免疫后小鼠抗体滴度变化Fig.3 Changes of antibody titers in mice immunized with brucellosis vaccine (S2 strain) via mucosal and injection vaccination

2.4 不同黏膜免疫及注射免疫对小鼠的保护指数比较 小鼠免疫后攻毒，采集脾脏检测各组小鼠出菌指数，结果显示，在对照组小鼠脾脏均分离到攻毒菌并且出菌指数为6.47 的前提下，各免疫组的单位保护从高至低分别为：注射免疫 4.08、阴道免疫3.89、点眼免疫 3.41、口服免疫 3.32 和直肠免疫3.25 (表3)，阴道免疫组和点眼免疫组的单位保护与注射免疫组的单位保护接近。表明黏膜免疫对小鼠具有较好的免疫保护。

表3 不同黏膜免疫及注射免疫对小鼠的保护率比较Table 3 Comparison of protection rates of the mice immunized via mucosal administration and injection vaccination

3 讨 论

布鲁氏菌病疫苗通过黏膜免疫可以降低免疫抗体的反应强度，并减少反应时间，有利于疫病监测等防控技术的实施[12-13]，但免疫时因动物咳嗽、打喷嚏、流唾液等导致疫苗菌向体外扩散带来的安全性问题。本研究采用温敏凝胶搭载布鲁氏菌病疫苗，将疫苗菌固定于免疫的黏膜部位，限制了其向环境中释放，提高了黏膜免疫的安全性。不同时间检测免疫部位的周边体表排菌情况表明，相比常规用生理盐水稀释的疫苗，凝胶疫苗在黏膜免疫部位的体外排菌明显减少。从凝胶疫苗的特性推测，其对气溶胶形式的排菌也会有明显抑制作用，但这需要可检测到全部排菌量的装置才能进行进一步研究。本研究显示，阴道免疫是4 种黏膜免疫途径中排菌量最少的，并且在免疫操作时将疫苗注入体腔内，避免了免疫时的疫苗暴露，是4 种黏膜免疫中能减少疫苗流失和提高相应安全性的最佳途径，与已有报道一致[14-15]，结合凝胶的相对定位作用，推断其效果应该会更好。由于阴道黏膜免疫只适用于母畜，因此本研究对直肠免疫途径进行了初步探究，排菌检测显示其安全性高于口服，其血清学反应与阴道免疫相近，免疫效果与口服相近，但直肠免疫涉及动物排便等不可控因素，因此对其实用性需深入评价。

本研究还比较了不同黏膜免疫及注射免疫方式的抗体消长规律及免疫保护效果，结果显示黏膜免疫产生的抗体水平低、持续时间短。4 种黏膜免疫均显示了良好的保护作用，其中，阴道灌注和点眼的免疫保护效果接近传统的注射免疫，进一步证实了黏膜免疫可以作为布鲁氏菌病疫苗免疫的有效途径，同时也提供一种有利于鉴别免疫与自然感染，以及布鲁氏菌病疫情监测的免疫方式。