沙门菌果蝇感染致死模型构建及其评价

沙门菌属(Salmonellaspp)属肠杆菌科，是一大群寄生于人类和动物肠道内、生化反应和抗原构造相似的革兰阴性杆菌。沙门菌是一种重要的食源性人兽共患细菌的致病菌，也是研究细菌致病机理的模式菌，是目前国内外研究最为广泛和深入的病原菌之一[1]。

至今，考夫曼-怀特抗原表中沙门菌的血清型可达到2 610种以上。根据对宿主嗜性的不同，沙门菌可以分为3个群：1) 泛嗜性沙门菌，如鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌；2) 偏嗜性沙门菌，如猪霍乱沙门菌和都柏林沙门菌，3) 专嗜性沙门菌，如伤寒与甲、乙、丙三型副伤寒沙门菌。根据对宿主致病能力不同，沙门菌分为无毒型和致病型。尽管沙门菌多种多样，但许多是对宿主不致病的。致病型沙门菌又分为全身感染型和局部型，全身感染型是指沙门菌能够扩散至全身，各组织中均有细菌分布；局部感染型是指仅仅在胃肠道感染后，引起胃肠道炎症[2]。

为了抵抗病原微生物(细菌，病毒，真菌和寄生虫)不断威胁，人类和动物这些病原菌感染宿主进化出了强大的免疫防御机制。先天免疫作为第一道防线，破坏入侵的微生物，并引发有助于阻止病原微生物攻击的炎症。获得性免疫致敏的T细胞和B细胞，产生杀伤细胞和抗体，清除病原微生物及感染细胞[3-4]。

果蝇作为一种模式生物，在胚胎发育、基因表达调控、疾病发病机制以及昆虫先天免疫等方面的研究发挥了重要的作用。果蝇的先天免疫系统包括细胞免疫和体液免疫,当其遭受细菌、真菌和病毒等病原体攻击时，果蝇能通过细胞吞噬、集结、包囊作用以及产生抗菌肽等方式来清除入侵的微生物[5]。在研究沙门菌致病机理过程中，主要以鼠感染模型和本宿主感染模型为主，以果蝇为感染模型的研究相对较少。为了深入研究沙门菌致病机理，在本研究中利用沙门菌的果蝇感染模型，以不同血清型沙门菌及突变株为研究对象，饲喂和针刺法为沙门菌感染方式，果蝇死亡为观察结果，比较沙门菌毒力，发现不同血清型沙门菌毒力差异，为后续利用果蝇肠道感染模型研究沙门菌高毒力的功能基因鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1菌株与果蝇 鼠伤寒沙门菌SL1344，14028S和肠炎沙门菌C50041及其突变株C50041ΔspiC为实验室保存。CS型果蝇和yw型果蝇，CS型果蝇为野生型黑体红眼纯种果蝇，yw型果蝇则为黄体白眼纯种果蝇，由合作者扬州大学韦有恒教授提供。

1.2 方法

1.2.1果蝇及生长环境 3 d龄CS果蝇和yw果蝇被使用，并饲养在果蝇管中，其食物配方为：8.5%、2.4%酵母粉、3.0%蔗糖、1.0%琼脂；培养条件为：温度为25 ℃，湿度为60%。

1.2.2沙门菌培养 将沙门菌三区划线接种于LB固体培养基，培养过夜，取新鲜单菌落接种于100 mL LB 液体培养基中培养16 h，离心收集细菌，总量约1.0×1011CFU。

1.2.3沙门菌感染果蝇 饲喂法感染果蝇：将沙门菌在5%的蔗糖中配成浓度为OD600为100的悬液，加至滤纸上，将果蝇放在滤纸上培养，每天更换带有沙门菌的滤纸。针刺法感染果蝇：用细针蘸取OD600为100的沙门菌菌悬液，刺入果蝇背部，然后将果蝇放至正常的果蝇培养基上培养，每隔2 d更换新鲜的含沙门菌培养基。每个感染组有3个生物学重复。

1.2.4活果蝇计数 将感染后的果蝇放于培养箱中，每隔3 h计数仍然存活的果蝇数目。根据存活的比例作存活曲线。

2 结 果

2.1沙门菌饲喂法肠道感染果蝇的毒力分析 将鼠伤寒沙门菌SL1344，14028S和肠炎沙门菌C50041及其突变株C50041ΔspiC分别单菌落培养50 mL，离心浓缩，用5%蔗糖(含2%亮蓝)调整浓度至OD600=100，每组用0.5 mL浓缩沙门菌感染30只果蝇，间隔3 h计数活果蝇数，计算果蝇存活率。图1 和图2显示， 肠炎沙门菌与鼠伤寒沙门菌对果蝇的致死能力有显著的差别，CS果蝇品系存活率0%，yw果蝇品系存活率低于20%。而鼠伤寒沙门菌饲喂法感染CS果蝇品系和yw果蝇品系存活率高于90%。

2.2沙门菌针刺法非肠道感染果蝇的毒力分析 将鼠伤寒沙门菌SL1344，14028S和肠炎沙门菌C50041及其突变株C50041ΔspiC分别单菌落培养50 mL，离心浓缩至OD600=100，每组用0.5 mL浓缩沙门菌针刺法感染30只果蝇腹部，间隔3 h计数活果蝇数，计算果蝇存活率。图3和图4显示，肠炎沙门菌与鼠伤寒沙门菌对果蝇的致死能力有显著的差别，针刺法感染CS果蝇品系和yw果蝇品系存活率高于80%，针刺法存活率均高于60%。

图1 CS果蝇饲喂法感染不同沙门菌存活率Fig.1 Survival rate of CS drosophilas by feeding withSalmonellastrains

图3 CS果蝇针刺法感染不同沙门菌存活率Fig.3 Survival rate of CS drosophilas by acupuncture withSalmonellastrains

图2 yw果蝇饲喂法感染不同沙门菌存活率Fig.2 Survival rate of yw drosophilas by feeding withSalmonellastrains

图4 yw果蝇针刺法感染不同沙门菌存活率Fig.4 Survival rate ofywdrosophilas by acupuncture withSalmonellastrains

3 讨 论

在病原微生物致病机制研究过程中，有许多感染模型，除本宿主感染模型外，还有模式动物感染模型，如鼠感染模型，斑马鱼感染模型，线虫感染模型、果蝇感染模型等。

果蝇作为模式动物，有其独特的优势。果蝇基因组相对简单，果蝇共有4对染色体，编码超过14 000个基因，其中3对染色体含有基因组中的大部分基因。研究证明，约75%与人类疾病相关的基因在果蝇体内可以找到同源基因[6]，哺乳动物和果蝇的同源基因在核苷酸水平或蛋白序列上的整体同源性达到 40%，而在保守的功能区域，同源性可达到80%～90%[7]。另外，果蝇作为模式生物的主要优势之一就是其基因的可操纵性[8-9]。

果蝇已成为研究沙门菌致病机制及宿主对病原菌耐受机制的重要模式生物[10]。Hoffman因在果蝇中发现了天然免疫系统的Toll受体(类似于哺乳动物的TLR受体)[11]。Brandt等利用果蝇-沙门菌模型，阐明宿主的TNF通路与沙门菌毒力因子PslrP的作用和宿主耐受机制[12]，野生型沙门菌注射至果蝇体内，可以导致果蝇死亡，而注射PslrP缺失菌株，仅引起果蝇的慢性感染；同样注射野生型菌株，也仅引起eiger(TNF同源基因)基因突变果蝇的慢性感染。Lee等利用果蝇-沙门菌模型，发现PGLYBP2(一种识别细菌表面肽聚糖的识别蛋白)在粘膜防御中保护宿主的作用[13]。Shinzawa利用果蝇遗传突变，筛选发现p38在引导果蝇血细胞吞噬沙门菌过程中发挥重要作用[14]。Jones等在果蝇中发现毒力因子AvrA通过调节JNK通路抑制宿主的免疫反应和被感染细胞的凋亡，从而使细菌能够繁殖[15]。沙门菌是细胞内病原菌，可以在宿主细胞内增殖。果蝇的S2细胞是来源于果蝇胚胎血祖细胞的细胞系，具有细胞吞噬、产生抗菌肽等能力，被广泛用于天然免疫的调节机制研究。近年来，利用S2细胞研究细胞内病原菌如李斯特菌、结核杆菌等在细胞内的增殖机制取得重要进展。果蝇S2细胞也可用于沙门菌在细胞内的增殖研究[16]。

沙门菌是研究病原菌致病机制的一种模式病原微生物。沙门菌对不同的宿主的致病能力不同，可能与菌株的宿主嗜性差异有关。从该研究结果分析，鼠伤寒沙门菌对果蝇无论是饲喂法还是针刺法感染，致死率都不是很高，显示其对果蝇的毒力较弱，与其它研究结果一致[12]。而肠炎沙门菌则不同，饲喂法显示其毒力很强，而针刺法则显示其毒力较弱。而在沙门菌鼠感染模型中，这几种沙门菌均具有很较强的毒力。有趣的是C50041ΔspiC基因缺失株与C50041野生株沙门菌在果蝇感染上模型无明显差异，而在鸡感染模型上则有显著的差异[17]，而鼠伤寒沙门菌spiC基因后缺失株在鼠感染模型上显著降低毒力差异[18]，表明spiC对于鼠是重要的毒力因子，而对果蝇则不是重要的毒力因子，提示spiC的功能具有宿主特异性或有特定的互作蛋白。从本研究结果分析推测，这2种细菌可能对果蝇存在不同的致病机制，肠炎沙门菌果蝇肠道感染的高致病性可能依赖肠道感染，而鼠伤寒沙门菌则不依赖。

在假单胞菌的果蝇感染研究中，发现了果蝇几种影响肠道抗感染的免疫新因素，这些基因表达不是来自单一基因，而是多个基因协同工作的。其中一组基因与分泌抵抗微生物的分子，提高抗病原菌能力有关。另一组基因与降低活性氧产生，降低免疫反应，间接减少炎症对肠道的伤害有关。还有些基因有助于加速肠道细胞组织的愈合。而对照组的果蝇则缺乏相关的基因组，这就意味着，果蝇对病原菌肠道感染的敏感性受到复杂的调节[19]。从鼠伤寒沙门菌和肠道沙门菌果蝇肠道感染存在不同的毒力，鼠伤寒沙门菌果蝇肠道感染耐受，而肠道沙门菌果蝇肠道感染敏感，对沙门菌毒力因子及果蝇肠道感染耐受/敏感的机制需要深入分析。该沙门菌感染果蝇模式能够为后续沙门菌肠道感染高致病性的功能基因鉴定及其机制奠定坚实基础。

利益冲突：无

本文引用格式：耿士忠, 席俊萌, 杨家兴, 等. 沙门菌果蝇感染致死模型构建及其评价[J]. 中国人兽共患病学报, 2019,35(4): 311-314. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.028