磁场和基质对中华鳖孵化性比和孵化率的影响

刘 飞，李戈锐，张家瑜，徐 倩，杨福忠，李 明，史习刚，谢春华，席在星

(1.湖南文理学院，环洞庭湖水产健康养殖及加工湖南省重点实验室，水产高效健康生产湖南省协同创新中心，湖南常德 415000；2.湖南省汉寿县特种水产科学研究所，湖南常德 415000；3.大湖水殖股份有限公司，湖南省水产工程技术研究中心，湖南常德 415000)

中华鳖(Pelodiscussinensis)，属爬行纲(Repitlia)龟鳖目(Testudinata)鳖科(Trionychidae)鳖属(Pelodiscus)，是我国南方重要的养殖品种，尤以地理标志保护产品“汉寿甲鱼”著名[1-2]。雄性中华鳖具有生长速度快、裙边厚实、可食比例高的特点，为商品鳖养殖优先选用；因种质资源退化和原生境破坏，雌性中华鳖为原良种保护和繁育所需[3-4]。因此，对于中华鳖的性别分化研究除了理论意义外[5～7]，还具有较大的生产实践意义。

已有很多研究工作表明，在24～32 ℃孵化环境中，随温度升高，中华鳖雌性比率降低，雄性比率升高，胚胎的孵化率提高，孵化周期也就越短。中华鳖性别决定为温度依赖型(temperature dependent sex determination, TSD)[8]，但也有研究指出中华鳖存在微小性染色ZW，属于基因型性别决定机制(genetic sex determination, GSD)[9]。当前，中华鳖胚胎分化的研究重点在雄性化诱导，主要方法有3种：一是孵化温度控制；二为性激素和化学物质诱导；三是温度和激素集合处理[10～13]。这3种方法需人工操作，设施设备要求多，工作量大，效果不稳定。目前，有关中华鳖胚胎的雌性化诱导工作报道极少，对除温度、湿度外的其他环境因子影响中华鳖性别决定和性腺分化的报道也极少。

本研究拟采用物理手段(孵化基质、磁、声、光等)影响中华鳖胚胎性别分化方向，试图找到安全、有效、简便的方法改变中华鳖孵化性比和提高孵化率，为中华鳖的人工繁育和种质资源保护工作提供理论与技术上的参考。

1 材料与方法

1.1 材料来源和孵化环境

孵化实验在湖南省汉寿县特种水产科学研究所中华鳖良种场于2017年7月中旬-9月上旬进行。早上自亲鳖池塘旁的产卵沙场中收集鳖卵(蛋)，挑选受精卵排列放置于孵化房子的塑料盆，待第二天孵化实验用。

在4间18 m2盖瓦单层红砖房(3 m×6 m×3 m)内进行室内环境孵化，无加温措施。实验期每日上午与晚上各记录一次空气和基质中的温度、湿度；整个夏季，孵化室内温度在23～38 ℃，平均为28.7 ℃；空气相对湿度在62%～82%，平均为75.7%；孵化基质含水量保持在在8%左右；孵化基质温度在24～36 ℃，平均29.3 ℃。

1.2 实验分组

实验所用木箱(50 cm×40 cm×10 cm)底层均铺设3 cm土壤，其中磁场处理组所用木箱底部内面固定了10块扁平磁铁(190 mm×70 mm×18 mm)，实验磁场为非均匀性非电流静磁场，铁氧永磁体型磁铁来自徐州市恒通磁铁公司。受精卵(蛋)按动物极朝上间隔排列整齐后，覆盖不同孵化基质(土壤或蛭石)。依据中华人民共和国国家标准《中国土壤分类与代码》(GB/T 17296—2000)，实验所用土壤种类为红壤类(A13)典型红壤亚类(A131)灰泥质红壤属(A13117)中的灰红沙土(A1311712)，是发育于石灰岩等碳酸岩类残坡积物母质的土壤。土壤粒径在0.05～0.02 mm；蛭石粒径在 0.1～0.3 mm。基质含水量在6%～10%。每个木箱中受精卵总数 390～430个，受精卵间间距大约为0.5 mm。

实验设计分为3组，每组处理和对照各设计3个平行：第1组和第2组为磁场N极处理组(CN)和磁场S极处理组(CS)，实验组和对照组的基质均为土壤，两组鳖卵位置的磁感应强度(高斯仪，SJL-1，南京山特仪器有限公司)平均为1.2 mT，作用时间为整个孵化期；第3组，蛭石基质处理组(Z)与土壤对照组的孵化基质分别为蛭石与土壤。

1.3 稚鳖雌雄分别(性别鉴别)方法

于11月份后对孵化后90～110日龄的中华鳖稚鳖采用3种方法进行性别鉴别，每个实验组的样品数不低于200个。方法1为第二性征观察测量法，解剖镜观察尾部形态、泄殖孔的位置来判别，雄性稚鳖尾长、呈锥形，且超出裙边，泄殖腔孔近尾中部；雌性稚鳖尾宽短，未超出裙边，末端骤然变细且呈结节状，泄殖腔孔近尾基部[14]；方法2为第二性征观察测量法，解剖镜观察泄殖腔(泄殖孔)中有无阴茎、阴茎大小和黑斑(阴茎退化痕迹)来判别[13]； 方法3为显微解剖观察法，体视镜观察性腺形态与大小、有无输卵管来判别雌雄[15～17]。然后，依据上述方法分别的雌雄个体，全部取性腺部分固定或直接包埋，进行冰冻切片(Leica CM1950，德国莱卡公司)、苏木精-伊红组织染色(H.E stain)，显微镜(Nikon E100，日本尼康公司)观察精原细胞或卵原细胞、输卵管或输精管的特征来判别雌雄[15,16,18]，并计算雌性个体或雄性个体中的辨别正确率(%)。

使用精度为0.02 mm的数显游标卡尺(Mitutoyo CD-20AX, 日本)测量稚鳖第二性征器官的长度和直径。

1.4 数据统计方法

数据描述采用平均数(Mean)或平均值±标准差(Mean±SD)。实验组中孵化率和孵化性比的显著性分析采用SPSS 22.0进行独立样本T检验。

2 结果

2.1 中华鳖雄性与雌性稚鳖的第二性征和第一性征特点

剖开泄殖腔后可以明显地看到雌性稚鳖的阴茎可见、细小，黑斑凸起(图Ⅰ-1)。雄性稚鳖的阴茎明显、粗壮，棒状，阴茎龟头深褐色，腹面白色(图Ⅰ-2)。在粗壮和细小之间，一部分个体处于过渡大小。

从图Ⅰ-3、Ⅰ-4可见，稚鳖有左右对称的生殖腺，位于体后腹腔背面脊柱的两侧、肾脏(K)内侧；肾上腺(A)线状梭形，黄色。雌性个体的卵巢(O)为梭形，大小与同龄个体的精巢相当，表面不平滑，有系膜与腹腔相连；输卵管(OV)位于肾脏另一侧，白色管线状，不与卵巢相连，开口于卵巢的前方体腔，沿卵巢外缘下行，后端弯曲通入泄殖腔(图Ⅰ-3)。雄性个体的精巢(T)为乳白色，中央粗，两端细，表面光滑，外形规则；输精管不明显或难以观察到(图Ⅰ-4)。

在稚鳖性腺的组织切片中，输卵管(OV)明显可见(图Ⅰ-5)，而输精管难以观察到(图Ⅰ-6)。卵巢中，观察有卵原细胞(OO)和早期的初级卵泡(PO)，初级卵泡多集中在皮质部分(图Ⅰ-7)。卵原细胞直径大约2～6 μm，周围没有滤泡细胞(FC)；初级卵泡直径约为 30～60 μm，周围有少量的滤泡细胞，没有空泡出现(图Ⅰ-9)。精巢中，曲细精管(ST)开始形成，管腔不明显，内有精原细胞(SP)(图Ⅰ-8)；除了结缔组织基质和间质细胞(IC)以外，精原细胞分布散、数量较多，多集中于髓质(图Ⅰ-10)。

2.2 不同孵化条件下中华鳖的孵化情况

本实验在夏季室内自然条件下进行，各实验组中华鳖孵化期在43～47 d。从表1可见，蛭石基质中的中华鳖孵化率显著高于土壤介质(P<0.05)，平均为90.4%，比土壤介质组高出8.3个百分点。磁场N级处理与S级处理都极显著影响中华鳖的孵化率(P<0.01)，分别平均为51.0%与49.8%，比对照组分布降低28.9个百分点和31.7个百分点。

4.仔猪水肿。新生仔猪常因皮下水肿或浆 液过多造成死亡，可能是溶血性大肠杆菌所致或因缺碘、血液中蛋白质过低而引起的。

表1 不同孵化条件下中华鳖的孵化率

注：*T检验差异显著(P<0.05)；**T检验差异极显著(P<0.01)。下同

2.3 不同孵化条件下中华鳖的孵化性比情况

在依据方法1和方法2判别雌雄进行测量的样品中，雄性稚鳖的尾长在5.04～6.12 mm，泄殖腔孔距离尾基部长度为2.76～4.02 mm，尾端超出裙边的长度在0.70～1.92 mm；雌性稚鳖的尾长在4.54～5.52 mm，泄殖腔孔距离尾基部长度为2.80～3.50 mm，尾端离裙边的长度为0.58～1.56 mm。雄性稚鳖的阴茎直径在0.76～1.10 mm，自基部长度为2.56～3.04 mm，明显可见合拢的深褐色龟头(图2)；雌性稚鳖中可见退化的阴茎残迹(图1)，其直径0.44～0.52 mm，自基部长度为1.50 mm 以下。

从表2可见，采用观察第二性征为主的方法1、方法2计算的雌性占比与方法3得到的结果明显不同，在高于或低于对照组数据上有的方向相反，且没有规律。采用解剖观察第一性征(输卵管有无)为主的方法3辨别出的雌雄个体，进行了冰冻切片后观察精原细胞或卵原细胞的验证，方法3得到的每组雌性占比数据的准确率为100%。

磁场N极和S极处理可以显著提高中华鳖孵化的雌性占比(P<0.01)，分别平均为69.5%和68.3%，比对照组提高11.0个百分点和11.5个百分点；磁场N极和S极处理组间没有显著性差异(P>0.05)。土壤基质中孵化后雌性占比为56.6%，显著高于蛭石介质的48.2%(P<0.05)，提高8.4个百分点。土壤基质中雌性占比在56.6%～58.5%，比蛭石介质组有雌性占比较高的现象。

表2 不同孵化条件下中华鳖孵化后雌性占比情况

3 分析与讨论

3.1 中华鳖稚鳖的雌雄判别方法比较

一般把夏秋季已出壳到第二年越冬后的中华鳖，称为稚鳖；稚鳖的雌雄鉴定在性别分化研究中有关键地位，直接影响实验结果和效果的分析和判断。已有一些研究从外部形态学和第二性征解剖观察来判定中华鳖雌雄，如朱道玉[14]从尾部形态和泄殖孔位置，李慧君[17]和唐瑶[13]从外生殖器的明显与退化形态还有唐瑶[13]从壳长、壳宽、尾长、裙边宽等数量特征的统计分析。本实验结果中，中华鳖稚鳖第二性征的数量差异在毫米级别，测量范围间的基点难以分辨，达到测量基点固定和清晰的程度，受实验观察者主观影响。所以，用上述方法来分辨稚鳖雌雄的结果很难做到准确和有效，依此做出的结论可靠性也不高。

对通过输卵管的存在与否，计数雌雄个体的结果是准确的，并进行组织切片验证。孵化出壳后到180日龄稚鳖，卵巢类卵泡已经发育到初级卵泡期，曲细精管开始形成但不明晰[20]。所以说，解剖后体视显微镜或肉眼观察，依据肾脏旁白色细线状输卵管的存在与否和与精巢相连的输精管并不明显或不可见，可以正确判别稚鳖雌雄。这个结论与朱道玉[19]、叶玉珍等[20]、余文萍[11]的研究结果相一致。

3.2 孵化基质对中华鳖孵化率和孵化性比的影响

在中华鳖胚胎雄性化诱导方面，使用温度、激素、其他化学物进行处理可以实现[10～12]，但有关雌性化诱导的方法和措施鲜有报道。已有研究认为，通过温度影响睾酮芳香化酶和睾酮5α-还原酶的活性控制雌、雄激素转化，进而决定了个体的性别分化[9,12]；Sf1、Wt1、Sox9、Dmrt1、Dax1等基因参与了龟鳖类性别分化[23]。本实验中，土壤基质中孵化后中华鳖雌性比率达到56.6%，显著高于蛭石介质中的48.2%。由于孵化基质影响中华鳖或龟鳖类动物的雌雄性比或性别分化研究极少，所以其生理生化或分子机理也无从推测，有待更多、更深入的实验研究。

3.3 磁场对中华鳖孵化率与孵化性比的影响

磁技术具有无污染、无残毒、效果好、低成本的特点，是一种无公害处理新技术；磁场分为静磁场(稳恒磁场)和动磁场(变化磁场)，实验所用铁氧磁铁为非均匀性非电流静磁场类型之一。目前，生物磁学的研究工作主要集中在植物种子萌发与生根、微生物代谢、肿瘤细胞抑制、动物细胞粘附、细胞周期变化、细胞骨架变化等[24,25]；磁场生物作用机制的探讨是一个复杂而艰难的过程，推测认为与胞内钙离子信号通路或其他细胞膜受体蛋白带电分子有关[26]，与磁场中带电元素运动受到的洛伦兹力有关[24]，与酶结构中金属原子的顺磁性、酶蛋白的半导体性、酶分子构象及电荷传递变化有关[27,28]。

有关水产动物的磁场效应实验有一些报道。磁感应强度(0.07 T)和磁化水(0.05～0.7 T)处理可提高金鱼孵化率16%～31%，鱼苗生长速度增加30%～40%[29]；养殖奥利亚罗非鱼(Tilapiaaureas)可促进其生长，并增强其耐寒力[30]；磁场处理(0.2～0.7 T)后磁化水养殖草鱼和鲤鱼，草鱼的红细胞、白细胞、血红蛋白数量会有降低，鲤的红细胞溶血率会减弱或增强[31]；恒定电磁场(0～2.0 mT)下养殖100 g左右鲫鱼，血清中碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶的活性和蛋白含量明显受到抑制或减低，造成不利影响[32]。但是，目前磁场处理对龟鳖孵化效应的研究鲜有报道。

无论是磁场N极处理、还是S极处理，都显著降低中华鳖的孵化率，平均仅为49.8%～ 50.1%，比对照组降低28.9～31.7个百分点，可以认为出现致死现象。虽然本实验中为弱磁场处理(磁感应强度为1.2 mT)，但作用时间为中华鳖整个孵化期(45 d左右)，孵化过程中长时间受磁场作用是否会产生不利影响，还有待下一步实验研究。从孵化后个体雌性占比数据来看，磁场处理明显导致了胚胎雌性化诱导效果，磁场方向(N极、S极)并没有影响中华鳖的孵化后雌性占比(68.3%～69.5%)，比对照组提高11～11.5个百分点。Vanag 等[27]实验发现1～10 mT的磁场可影响动物细胞内酶的活性，改变其生化反应速度。磁场是否促进生成雌激素的睾酮芳香化酶的活性，或抑制生成雄激素的睾酮5α-还原酶的活性，是从生理生化水平探讨磁场导致中华鳖胚胎雌性化诱导机制的路径之一。磁场参数(类型、方向、强弱、均匀性、作用时间)和细胞因子(磁性、种类、敏感性、作用部位)是影响细胞生物学磁效应的因素[24]，对于磁场诱导中华鳖胚胎雌性化的现象和机理，还需更多的实验研究来探讨。

图版Ⅰ：中华鳖雌雄幼鳖的生殖器官形态与性腺组组学比较Plate Ⅰ：Comparison of reproductive organs morphology and gonads histology between female and male juvenile soft-shelled turtles,Pelodiscus sinensis图1、2 中华鳖稚鳖外生殖器(线条指示1 mm);图3、4 中华鳖稚鳖性腺解剖 (线条指示2 mm) ;图5、6 中华鳖幼鳖性腺切片观察(线条指示100 μm) ;图7、8 中华鳖幼鳖性腺切片观察(线条指示50 μm);图9、10 中华鳖幼鳖性腺切片观察(线条指示20 μm)图标说明：A：肾上腺；FC：滤泡细胞；FJT：雌性稚鳖生殖器；IC：间质细胞；K：肾脏；MJT：雄性稚鳖生殖器；O：卵巢；OO：卵原细胞；OV：输卵管； PO：初级卵泡；SP：精原细胞；ST：曲精小管；T：精巢。