绞股蓝对糖尿病肾病大鼠免疫功能的影响

郎志芳 刘兰涛 王洪伟 李姝

DN是糖尿病最常见的慢性并发症之一， 在我国， DN已成为血液透析的重要病因和糖尿病患者的主要死因［1］。目前，对DN还没有很好的治疗措施， 因此研究DN发病机制， 寻找有效的治疗手段对防治DN具有重大意义［2］。本次研究的目的在于观察并探讨绞股蓝对DN免疫功能的影响， 以40只大鼠作为研究样本展开研究， 现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源 本次研究共选取均为正常饲养环境下实验用大鼠40只， 随机分为正常参考组、DN比对组、绞股蓝高剂量组、绞股蓝中剂量组、绞股蓝低剂量组， 每组8只。

1.2 入选标准 ①大鼠质量在200～280 g。②实验用DN大鼠具备相应特征， 符合大鼠糖尿病肾病诊断标准。

1.3 研究方法 正常参考组均为正常大鼠。除正常参考组外， 其他组大鼠均腹腔注射STZ， 制备DN模型， 然后给予绞股蓝治疗， 其中， 绞股蓝低剂量组的绞股蓝药量为5 g/kg， 绞股蓝中剂量组为10 g/kg， 绞股蓝高剂量组为20 g/kg。

1.4 观察指标 10周后观察并对比各组大鼠TNF、IL-1、IL-6、 CD4+、CD8+和Th1、Th2以及免疫器官指数。其中TNF、IL-1、IL-6以酶联免疫吸附法测定， Th1、Th2经流式细胞仪测定。

1.5 统计学方法 采用SPSS23.0统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示， 采用t检验， 多组比较采用方差分析；计数资料以率(%)表示， 采用χ2检验。P＜0.05指标表示差异有统计学意义。

2 结果

①TNF、IL-1、IL-6水平：五组大鼠TNF、IL-1、IL-6水平比较差异具有统计学意义(F=108.91、22.23、5.71，P＜0.05)， 且正常参考组＜绞股蓝高剂量组＜绞股蓝中剂量组＜绞股蓝低剂量组＜DN比对组；提示绞股蓝可有效降低DN大鼠的TNF、IL-1、IL-6水平， 且有明显的剂量依赖性。见表1。②CD4+、CD8+、Th1水平：五组大鼠CD4+、CD8+和Th1水平比较差异具有统计学意义(F=71.72、13.89、22.34，P＜0.05)；CD4+水平：正常参考组＜绞股蓝高剂量组＜绞股蓝中剂量组＜绞股蓝低剂量组＜DN比对组；CD8+和Th1水平：正常参考组＞绞股蓝高剂量组＞绞股蓝中剂量组＞绞股蓝低剂量组＞DN比对组；提示绞股蓝在CD4+、CD8+、Th1指标表达中具有剂量依赖性。见表2。③Th2、胸腺指数、脾脏指数水平：各组大鼠Th2、胸腺指数和脾脏指数水平比较差异具有统计学意义(F=23.69、36.85、64.84，P＜0.05)；提示应用绞股蓝后DN大鼠胸腺指数、脾脏指数均增加， 且具有明显的剂量依赖性。见表3。

表1 各组大鼠TNF、IL-1、IL-6水平比较( ±s, pg/ml)

表1 各组大鼠TNF、IL-1、IL-6水平比较( ±s, pg/ml)

注：五组比较, P＜0.05

组别 只数 TNF IL-1 IL-6正常参考组 8 50.34±6.12 18.10±2.93 11.36±2.01 DN 比对组 8 59.46±5.17 25.39±3.71 18.32±3.48绞股蓝高剂量组 8 53.17±5.78 19.64±2.62 13.29±2.75绞股蓝中剂量组 8 56.79±4.98 22.61±2.88 15.49±2.43绞股蓝低剂量组 8 57.14±4.92 23.05±3.02 15.67±3.04 F 108.91 22.23 5.71 P 0.00 0.00 0.00

表2 各组大鼠CD4+、CD8+和Th1水平比较( ±s)

表2 各组大鼠CD4+、CD8+和Th1水平比较( ±s)

注：五组比较, P＜0.05

组别 只数 CD4+(%) CD8+(%) Th1(‰)正常参考组 8 35.48±4.05 23.87±3.08 32.87±4.11 DN 比对组 8 45.39±4.76 17.89±2.78 21.78±3.20绞股蓝高剂量组 8 37.69±4.23 22.51±3.12 29.69±4.73绞股蓝中剂量组 8 42.03±4.87 20.30±2.96 24.83±3.55绞股蓝低剂量组 8 42.34±4.62 20.11±2.90 24.22±3.47 F 71.72 13.89 22.34 P 0.00 0.00 0.00

表3 各组大鼠Th2、胸腺指数和脾脏指数水平比较( ±s)

表3 各组大鼠Th2、胸腺指数和脾脏指数水平比较( ±s)

注：五组比较, P＜0.05

组别 只数 Th2(‰) 胸腺指数(mg/10 g) 脾脏指数(mg/10 g)正常参考组 8 20.57±5.21 38.24±4.28 46.51±4.53 DN 比对组 8 33.25±4.88 28.95±4.19 34.87±3.99绞股蓝高剂量组 8 22.17±4.73 36.03±5.01 43.18±4.34绞股蓝中剂量组 8 29.45±4.67 32.51±4.03 37.25±4.03绞股蓝低剂量组 8 29.68±4.79 31.88±4.16 37.12±4.10 F 23.69 36.85 64.84 P 0.00 0.00 0.00

3 讨论

3.1 研究背景 DN的发病机制及其进行性肾损害的机制至今尚未完全明了。而肾小球硬化是多种原因导致肾小球损伤和病变的共同结局， 也是肾功能衰竭的主要病理基础。而炎症和免疫功能异常可导致、加重肾脏损伤， 导致DN的发生［3，4］。

绞股蓝含有绞股蓝皂苷、氨基酸、蛋白质、脂肪、黄酮类、糖类、无机元素纤维素和维生素等， 2002年3月5日国家卫生部(现卫健委)将其列入保健品名单。绞股蓝的功能有抗衰老、免疫调节、抗肿瘤、抗心肌缺血缺氧和脑缺氧、脂代谢调节、肾脏和肝脏保护作用等， 但是关于绞股蓝影响DN的免疫功能研究报道相对较少， 本次研究的目的就在于探讨绞股蓝在DN大鼠中对其免疫机能的影响， 从而为临床应用提供相应的经验积累。

3.2 对免疫功能的影响 大鼠灌服绞股蓝煎剂10 g/kg或30 g/kg， 连服 10 d， 可明显增加脾脏重量 ， 体重亦比正常参考组明显增加， 能明显促进单核巨噬细胞系统对血中胶体碳粒的廓清速率， 提高单核细胞的吞噬功能， 30 g/kg剂量亦可使胸腺重量增加［5］。

正常大鼠灌服绞股蓝共50 mg/kg， 连服10 d， 对脾重呈双相调节作用， 即对于小于中位数的脾重(mg/10 g体重)可使之增加， 大于中位数的脾重则使之减小；对胸腺重量(mg/10 g体重)小于中位数者无明显影响， 大于中位数者亦可使之明显减小。DN大鼠灌服绞股蓝200 mg/kg或400 mg/kg， 连服10 d，可明显对抗环磷酰胺引起的胸腺和脾脏重量减轻。小鼠灌服绞股蓝水煎醇沉水提物0.5 g/kg、1.0 g/kg和2.0 g/kg， 连服5 d， 可增加胸腺重量， 1.0 g/kg及2.0 g/kg时才能增加脾重。DN大鼠灌服绞股蓝400 mg/kg， 连服5 d， 对环磷酰胺所致胸腺、脾脏和肠系膜淋巴结重量的减轻有明显拮抗作用， 但对正常动物免疫器官重量则无明显影响。

国外有研究表明， DN大鼠灌服绞股蓝皂苷300 mg/kg，连服7 d， 对体重、脾脏和胸腺重量均无明显影响， 但能显著加强腹腔巨噬细胞吞噬功能［6］。α-半乳糖诱发的小鼠亚急性衰老模型， 灌服3%绞股蓝浸膏(含生药150%)混悬液， 连服50 d， 可使明显升高的白细胞总数、淋巴细胞的百分率降低至接近正常参考组；使降低的中性粒细胞百分率升高至接近正常参考组；DN大鼠胸腺萎缩， 脾重增加， 用药后胸腺指数恢复， 脾指数也恢复正常；DN组血清溶菌酶含量显着降低，提示机体抗感染力下降， 服药组溶菌酶含量显著增加并超过DN大鼠组， 这提示应用绞股蓝后DN大鼠免疫机能得到改善。

除了研究免疫指标与免疫器官指数外， 还通过酶联吸附法动态测定了实验大鼠IL-2分泌情况， 应用不同剂量的绞股蓝大鼠可发生不同的免疫应激反应， 10 μg/ml应用绞股蓝时，大鼠脾脏和淋巴细胞可在刀豆蛋白A和脂多糖诱导下增殖，当剂量提高到200 μg/ml时大鼠脾淋巴细胞自发性增殖。

3.3 关于绞股蓝的毒理研究 虽然在研究中发现绞股蓝对免疫机能的改善功能具有剂量依赖特征， 但为探究绞股蓝的毒理作用， 进一步增加绞股蓝使用量， 当增加至1000 mg/kg时(灌服)， 实验大鼠未在72 h内死亡， 随着给药方式和剂量的调整， 可以确定腹腔注射的半数致死量为1850 mg/kg， 口服5 g/kg、10 g/kg均可见毒性， 且大鼠一般情况、体重增长、进食量、血、尿常规和病理组织学检查均未发现异常。

3.4 实验总结和应用前景 本项目具有较充分的前期研究工作。在前期工作中已经从绞股蓝抗氧化应激， 抗肾脏纤维化， 及其对炎性因子的影响方面证实了其对DN有一定的治疗作用， 为此次实验积累一定经验。硬件条件：实验室、实验仪器设备齐全， 实验用试剂充足， 研究人员具备足够的专业知识， 实验经费充足。

综上所述， 绞股蓝在DN临床中有良好的应用效果， 可有效改善患者免疫功能， 从而有利于患者身体健康和生活质量的提高。