乙型肝炎病毒S区基因突变对乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌患者预后的影响研究

吴忱思，赵乐，吴建华，王英南，张风宾，高立明，赵林，张卫国，张瑞星*

原发性肝细胞癌（HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一。HCC是目前全球发病率第5位、死亡率第2位的恶性肿瘤，每年约有70万人死于肝癌［1］，慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是导致肝癌发病的主要危险因素之一［2］。HCC患者的临床特征，包括肿瘤分期、肿瘤大小、病理类型、炎症程度和门脉瘤栓，是影响其预后的重要因素。HCC复发率高、治疗手段有限，因此患者的预后仍然较差［3-4］。

我国HCC的发病率呈逐年上升趋势，这主要与HBV感染流行有关，据世界卫生组织报道，全球每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌［5-6］。我国是乙型肝炎的高发区，根据第三次乙型肝炎流行病学调查统计，我国HBV的平均感染率为7.18%，其中慢性乙型肝炎患者高达3 000万人［7］。根据HBV全基因序列或S区基因序列差异，HBV可分为A～J 10个基因型，我国HBV基因型主要为B型和C型［8-9］。

HBV是已知真核细胞中最小的病毒，由不完全的环状双链组成，其中一条较长的为负链，由3 200个碱基组成，包含4个开放读码框架（ORF），即S、X、C、P基因区，分别编码外膜蛋白、X蛋白、核壳蛋白和聚合酶蛋白［10］。S基因区可分为3段，从上游开始依次为前S1（pre-S1）区、前S2（pre-S2）区和S区，HBV S区基因编码的226个氨基酸组成的蛋白质是乙肝表面抗原（HBsAg）的主要组成部分；pre-S2区和S区基因共同编码中蛋白；pre-S1区、pre-S2区和S区3部分基因共同编码大蛋白［11］。由于HBV缺乏DNA酶的校正功能，所以HBV特别容易引发基因突变［12］。近年来，多项研究表明HBV基因突变与肝癌患者发病密切相关［13-16］，HBV S区基因突变与HCC发病机制的关系已经成为研究热点，本研究旨在探讨HBV S区基因突变与HCC患者预后的关系。

1 材料与方法

1.1 肝癌组织标本采集 本研究于2007—2009年采集在河北医科大学第四医院行外科手术治疗的46例乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌（HBV-HCC）患者的肝癌组织标本，患者均被证实感染HBV，并排除其他肝脏疾病。通过患者的临床症状、体征、肝脏CT和/或MRI、血清甲胎蛋白（AFP）等检查，诊断为HCC并行HCC根治术，在术前及术后均未接受美国国立综合癌症网络（NCCN）指南所推荐的放化疗、靶向治疗及局部介入治疗。46例患者中女6例、男40例，中位年龄52岁。

本研究价值：

原发性肝细胞癌（HCC）的发病率逐年上升，已经成为威胁我国人民健康的主要疾病，乙型肝炎病毒（HBV）是导致其发病的重要相关因素。我国是乙型肝炎的高发区，有研究表明HBV基因突变与乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌（HBVHCC）患者发病密切相关，但是关于基因突变与肝癌患者预后的研究相对较少，因此研究基因突变对HBV-HCC患者预后的影响，对于提高患者生存期具有极其重要的意义，本研究发现门脉瘤栓和HBV S区529位点与HBV-HCC患者术后预后密切相关，这一结果有利于在临床中识别不良预后的HBV-HCC患者，及早治疗，从而延长其生存期。

1.2 一般资料收集 年龄、性别、CHILD分级、基因型、肿瘤数目、门脉瘤栓、TNM分期、肿瘤大小。

1.3 术后随访 通过电话对患者或其家属进行随访，随访时间截至2012年9月，生存时间从术后第1天开始计算，至死亡之日或随访结束日为止。以月为单位计算生存期，随访时间为3年，每3个月进行1次随访。本研究经过河北医科大学第四医院伦理委员会批准。

1.4 基因组DNA提取、PCR扩增及基因测序 采集肝癌组织标本置于-80 ℃冰箱保存，应用Promega公司DNA试剂盒，经过细胞核裂解、RNA降解、蛋白沉淀、离心、纯化等步骤提取基因组DNA，并置于-20 ℃冰箱保存。通过美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/5536）查找引物（见表1）。对HBV S区的DNA序列进行PCR扩增，采用美国Promega公司的PCR无色体系预混试剂盒，使用美国基因有限公司PCR仪（AS Applied Biosystems 9902）进行目的基因扩增。其产物应用Life Technologies公司的ABI 7300 TaqMan平台，通过多重PCR法测出HBV-HCC患者肝癌组织的HBV基因型，并进行循环测序及分析。为确保测序的准确性，对同一个样本应用双向重复测序方法，以明确HBV S区基因的突变位点。

1.5 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。采用Log-rank检验分析生存率，采用Cox比例风险模型对HBV-HCC患者术后生存影响因素进行分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同一般资料HBV-HCC患者术后3年生存率比较 46例HBV-HCC患者的基因分型为25例B型、21例C型。不同门脉瘤栓、TNM分期、肿瘤大小的HBVHCC患者3年生存率比较，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.2 不同HBV S区基因突变位点HBV-HCC患者术后3年生存率比较 本研究对HBV S区的DNA序列进行基因测序，共发现13个位点的突变频率＞5%，其中529位点、735位点不同碱基HBV-HCC患者术后3年生存率比较，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

2.3 HBV-HCC患者术后生存影响因素分析 将临床指标（年龄、性别、CHILD分级、肿瘤数目、门脉瘤栓、TNM分期、肿瘤大小）和基因突变位点纳入Cox比例风险模型进行分析，结果显示门脉瘤栓、529位点是HBV-HCC患者术后生存的独立影响因素（P＜0.05，见表4）。

3 讨论

HBV属嗜肝DNA病毒科，由于缺乏HBV聚合酶的校对功能，因此特别容易发生基因突变，HBV比其他DNA病毒的突变率高10倍以上［6，11］。由于HBV感染可以引起肝脏的病理及免疫损伤，基因突变的积累会直接影响病毒的活性和免疫应答的强度，因此HBV基因突变所导致的病毒生物学变化在肝脏损伤过程中发挥着重要的作用［17］。研究发现，HBV突变主要集中在基因组的某些特定区域，例如基本核心启动子（BCP）、pre Core/Core区和pre S/S区［18］。本研究重点探讨HBV S区基因的突变与HBV-HCC患者术后3年生存率的关系，并通过生存分析鉴定出与HBV-HCC患者预后相关的突变位点为529位点。

表1 HBV S区基因扩增和测序引物Table 1 Primer pairs used for amplification and sequencing of the S gene region of HBV

表2 不同一般资料HBV-HCC患者术后3年生存率比较Table 2 Postoperative 3-year survival rate in HBV-associated HCC patients with different data

HBV S区是HBV复制的关键区域，其所编码的蛋白是HBsAg的主要组成部分，由S区基因编码的HBsAg是HBV主要的抗原域，由226个氨基酸组成，含有一系列的构象性抗原表位，其主要的亲水区位于aa99-169，其中最重要的免疫功能区域是位于aa124-147的“a”决定簇［11，19］，是HBsAg的主要作用位点。HBsAg可以刺激机体产生抗体从而清除HBV，有研究表明“a”决定簇区域的突变可能诱导HBsAg的抗原性或病毒的适应性发生改变，甚至产生免疫逃逸，该区域的无义突变可以诱导HBsAg抗原性的改变，从而影响特异性抗体的产生［20-21］。如果突变位点位于“a”决定簇区域，该突变不会导致S区基因编码的氨基酸替代，但是pre S/S区基因位点的突变，可能引起HBV聚合酶中的rtD134N的替代，从而导致HBV聚合酶的功能改变，进而影响病毒复制［22］。本研究发现，HBV S区529、735位点与HBV-HCC患者生存相关，目前尚未见国内外文献对于这两个位点的报道。既往研究表明，HBV S区基因突变可以诱导几个特定的膜蛋白产生，从而激活内质网应激传导通路，由此所产生的细胞毒性作用可以促进肝脏损伤并诱发疾病，通过内质网应激及大量活性氧的产生，可以引起DNA氧化损伤和基因组不稳定，最终导致HCC的发生［6，23-25］。国内外对于HBV S基因与HCC预后机制的研究尚未见报道，HBV S基因可能通过以上氨基酸替代、氧化损伤等过程，参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭和凋亡，导致肝癌的复发与转移，从而影响了患者的生存期及预后。由于研究的局限性及发病机制的复杂性，对于HBV S基因突变与HCC致病及预后关系的研究有待进一步探讨，本研究为单中心研究，如果扩大样本量，将其推广到多中心进行联合研究，并进行长期观察，将有利于从基因水平深入探讨肝癌的发病机制，从而改善患者的预后。

表3 不同HBV S区基因突变位点HBV-HCC患者术后3年生存率比较Table 3 Postoperative 3-year survival rate in HBV-associated HCC patients by mutations in the S gene region of HBV

表4 HBV-HCC患者术后生存影响因素的Cox比例风险模型分析Table 4 Analysis of influencing factors for postoperative survival in HBV-associated HCC patients with the Cox proportional hazards model

总之，本研究发现了与HBV-HCC患者术后预后相关的HBV S基因突变位点，在临床上针对HCC患者进行相关HBV突变位点的基因检测，有助于鉴定具有不良预后的HBV-HCC患者并对其进行个体化治疗。该突变位点的发现对于提高HCC患者生存期、改善其预后具有重要意义。