玉米肽和姜黄素对酒精性脂肪肝的作用

魏 颖 尹 曼 陈 亮 潘兴昌 谷瑞增 蔡木易*

（1 中国食品发酵工业研究院有限公司 北京100015 2 北京市蛋白功能肽工程技术研究中心 北京100015）

脂肪肝（fatty liver disease，ALD）主要包括非酒精性脂肪肝 （non-alcoholic fatly liver disease，NAFLD）和酒精性脂肪肝 （alcoholic fatty liver disease，AFLD），涉及由简单的脂肪变性到脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化的转变。有研究表明，长期摄入酒精能够通过提高血液中AST 酶活和氧自由基水平促进脂肪肝的形成[1]。严重饮酒患者一般在饮酒1年后就会患有脂肪肝。肝脏是酒精代谢的主要器官，其在肝脏中的代谢主要依赖于NAD+的氧化还原酶系、 过氧化氢酶及细胞色素P450 酶系，产生大量的NADH，抑制脂肪酸的氧化并产生大量的ROS，引起脂肪在肝脏中的积累和肝脏的损伤。同时，酒精会增加活化的巨噬细胞对酒精的敏感度和肠黏膜渗透性，引起肠道细菌产物如LPS 释放量的增加，引发炎症反应，进一步促进ROS 的产生[2-3]。

治疗AFLD 最主要的是消除机体炎症反应和清除自由基[4]。天然植物成分中含有各种抗氧化物质，且目前关于抗氧化物质对AFLD 的干预作用已有许多研究报道。姜黄素是一种多酚类物质，具有清除自由基和抗炎的作用，对小鼠急性酒精性肝损伤具有一定的保护作用，并提高急性酒精中毒小鼠的抗氧化力[5-6]。同时，玉米肽具有很好的保肝解酒功效，其支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）含量很高，而支链氨基酸具有上调过氧化物酶体相关基因的表达，增强机体免疫力，促进肝细胞的再生等功效，能够缓解肝病患者病情的恶化[7-8]，更有相关试验来验证玉米肽保肝解酒的功效[9]。本试验采用OA 和乙醇联合诱导HepG-2 细胞建立AFLD 模型，探讨姜黄素和玉米肽复配对AFLD 的干预作用，为AFLD 营养食品的开发奠定试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米肽，实验室制备；姜黄素，三生（中国）健康产业有限公司提供；MTT、OA，Sigma 公司；牛血清白蛋白（BSA），Amresco 公司；DMEM 培养基，Hyclone 公司；胎牛血清（FBS），四季青公司；胰蛋白酶、红细胞裂解液、缓冲液PBS、青霉素链溶液、SOD 检测试剂盒、LDH 检测试剂盒、MDA 检测试剂盒，碧云天生物技术研究所；ALT、AST、ADH 检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；TG 检测试剂盒，浙江东瓯诊断产品有限公司；DMSO，西陇化工股份有限公司；无水乙醇，北京化工厂。

1.2 仪器与设备

Spectra MR 多功能酶标仪，美国Dynex 公司；ESCO AC2-6S1 生物安全柜，新加坡艺思高科技有限公司；HF90 二氧化碳培养箱，力康生物医疗科技控股有限公司；BD C6 流式细胞仪。

1.3 试验方法

1.3.1 玉米肽和姜黄素对HepG-2 细胞增殖的影响 将处于对数生长期的细胞消化后，用DMEM完全培养基（含10% FBS 和1%青霉素链霉素溶液）调整细胞密度为105个/mL，接于96 孔板，每孔100 μL 细胞悬液。于CO2培养箱中培养24 h，细胞单层贴壁后更换DMEM 不完全培养基，加入玉米肽和姜黄素共同培养24 h，而后MTT 法检测细胞增殖率。增殖率计算公式：

1.3.2 玉米肽和姜黄素对ALFD 模型细胞的干预作用 将处于对数生长期的细胞消化后，用DMEM 完全培养基调整细胞密度为105个/mL，接于12 孔板，每孔1 mL 细胞悬液。于CO2培养箱中培养24 h，细胞单层贴壁后更换不完全DMEM 培养基，加入OA（1 mmol/L）、玉米肽和姜黄素共同培养20 h，而后加入0.6%的无水乙醇继续培养4 h，并设置空白对照组和相应BSA 单独添加组。分别检测上清中ALT、AST、LDH 及胞内TG、ADH、MDA、SOD 产生量，并用各孔的蛋白总量进行校正，评价玉米肽和姜黄素复配对AFLD 的干预作用。

2 mmol/L OA 溶液的配制：31.61 μL OA 和1.675 g BSA 溶于50 mL DMEM 不完全培养基中，调节pH 为7.2～7.4，超声至澄清液体状态，过滤除菌，备用。同时制备不含OA 的相应BSA 溶液。

1.4 统计学处理

采用SPSS16.0 统计软件对数据进行处理，试验结果以均值±标准偏差（Mean±SD）表示。采用组间t 检验，P<0.05 具有显著性差异，P<0.01 具有极显著性差异。

表1 各试验组所添加玉米肽和姜黄素质量浓度及共同作用浓度比例Table 1 The concentration and concentration ratio of corn peptide and curcumin used in the experiment

2 试验结果

2.1 玉米肽和姜黄素对HepG-2 细胞增殖的影响

由 图1可知，姜黄素在200 μg/mL 时对HepG2 细胞增殖率无显著性影响，玉米肽在高质量浓度2 000 μg/mL 时对HepG-2 细胞增殖仍无显著性的抑制作用。说明试验所选各样品浓度均不会影响HepG-2 细胞的正常生长。

图1 玉米肽和姜黄素对HepG2 细胞增殖的影响Fig.1 Effect of corn peptide and curcuminon proliferation of HepG2 cells

2.2 玉米肽和姜黄素对AFLD 模型细胞ALT 和AST 分泌量的影响

ALT、AST 是体内重要的转氨酶，是迄今为止国内外应用最为广泛的反映肝细胞损害的指标。ALT 只存在于肝细胞浆内，1%的肝细胞被破坏，血清中的量就会增加一倍；AST 20%存在于肝细胞包浆内，80%于线粒体中，在肝细胞轻度病变时，仅胞浆内的AST 逸出；而当病变严重时，线粒体中的AST 也会逸出[10]。而酒精肝在形成过程中，细胞受到炎症反应和ROS 的损伤，均会引起细胞外的ALT、AST 释放量增加。

由图2可知，较模型组，姜黄素和玉米肽单独作用组及复配组均可显著降低受损肝细胞ALT的分泌量（P<0.01），配方比例为1∶8（姜黄素∶玉米肽）时，抑制效果最好，分泌量仅为模型组的13.00%。由图3可知，较模型组，姜黄素和玉米肽均可显著降低受损肝细胞AST 的分泌量，配方比例为1 ∶8（姜黄素∶玉米肽）时，抑制效果最好，分泌量仅为模型组的37.51%。说明玉米肽和姜黄素复配对AFLD 具有干预作用，且均优于玉米肽和姜黄素单独作用组。

图2 玉米肽和姜黄素对AFLD 模型细胞ALT 分泌的影响Fig.2 Effect of corn peptide and curcumin on secretion of ALT of AFLD model cells

2.3 玉米肽和姜黄素对AFLD 模型细胞LDH 释放量的影响

LDH 属于存在于机体所有组织细胞胞质内的大分子，正常情况下，LDH 是不能通过或少量释出细胞膜，但在细胞膜受损伤、 通透性发生改变后，可通过受损细胞膜大量泄漏，通过检测LDH泄漏量可在一定程度上反映细胞膜的损伤程度。如前所述，AFLD 在形成过程中，会造成肝脏细胞损伤，通过检测LDH 泄漏量可以判断姜玉米肽和姜黄素对肝细胞的保护作用。

由图4可知，200 μg/mL 姜黄素及配方比例为1∶4 和1∶8（姜黄素∶玉米肽）均显著降低细胞LDH泄漏量（P<0.05）。较模型组分别降低细胞LDH 泄漏量的15.02%，24.91%和29.85%。说明玉米肽和姜黄素复配能够保护受损肝细胞，且均优于玉米肽和姜黄素单独作用组。

2.4 玉米肽和姜黄素对AFLD 模型细胞内TG累积的影响

TG 是人体内含量最多的脂类，肝脏可合成TG，但若TG 在肝脏中积累则会造成脂肪肝。AFLD 在形成过程中会产生大量的NADH，抑制脂肪酸的氧化，造成脂肪在肝脏中的积累，进一步恶化脂肪肝[2]。

图3 姜黄素和玉米肽对AFLD 模型细胞AST 分泌的影响Fig.3 Effect of curcumin and corn peptide on secretion of AST of AFLD model cells

由图5可知，200 μg/mL 姜黄素以及配方比例为1 ∶4 和1 ∶8（姜黄素∶玉米肽）均可显著降低受损肝细胞内TG 的累积（P<0.05），较模型组而言分别降低了细胞内TG 含量的20.53%，14.43%和21.24%。说明玉米肽和姜黄素复配具有抑制脂肪累积的作用，缓解AFLD，且配方比例为1∶8 的作用效果最好，优于玉米肽和姜黄素单独作用组。

2.5 玉米肽和姜黄素对AFLD 模型细胞MDA 产生量的影响

AFLD 在形成过程中会产生大量的ROS，造成细胞膜脂质过氧化，对细胞产生损伤[11]。MDA 是生物体内脂质过氧化的毒性终产物，会破坏DNA和蛋白质的合成以及干扰电子传递链的进行，进一步对细胞活性产生影响[12]。通过检测MDA 的产生量可以反映细胞内ROS 水平和细胞的受损状况。

由图6可知，姜黄素和玉米肽单独作用组及复配组均可显著降低受损肝细胞内MDA 的产生（P<0.05），且复配组要优于玉米肽单独作用组，说明玉米肽和姜黄素复配能够增强玉米肽的护肝功效。

2.6 玉米肽和姜黄素对AFLD 模型细胞SOD 活性的影响

SOD 是金属螯合酶，是生物体内清除自由基的首要物质。对于乙醇引起的机体肝中毒和过氧化，机体会过量表达SOD 来起到保护作用，而AFLD 会导致SOD 活性的显著下降，进一步导致脂质过氧化及肝损伤，可能是由于乙醇会导致其降解或干扰其转录后的调控[13-14]。通过检测添加样品前后AFLD 模型细胞SOD 的活性，可以很好地判断姜黄素和玉米肽复配对AFLD 模型细胞的自身抗氧化的影响。

图4 玉米肽和姜黄素对AFLD 模型细胞LDH 泄漏的影响Fig.4 Effect of corn peptide and curcumin on leakage of LDH of AFLD model cells

由图7可知，各试验组相比模型组均可显著促进受损肝细胞内SOD 的活力（P<0.01），其中配方比例为1 ∶4 和1 ∶8（姜黄素∶玉米肽）时的SOD活力分别是模型组的8.92 倍和8.06 倍。说明玉米肽和姜黄素复配能够增强AFLD 模型细胞的抗氧化力，缓解肝细胞的受损状况，且均优于玉米肽和姜黄素单独作用组。

图5 玉米肽和姜黄素对AFLD 模型细胞内TG 累积的影响Fig.5 Effect of corn peptide and curcumin on accumulation of TG of AFLD model cells

图6 玉米肽和姜黄素对AFLD 模型细胞MDA 形成的影响Fig.6 Effect of corn peptide and curcumin on formation of MDA of AFLD model cells

图7 玉米肽和姜黄素对AFLD 模型细胞SOD 活力的影响Fig.7 Effect of curcumin and corn peptide on catalysis activity of SOD of AFLD model cells

2.7 玉米肽和姜黄素对AFLD 模型细胞ADH 活力的影响

ADH 是酒精代谢的重要酶系，可转化乙醇为乙醛，再在乙醛脱氢酶作用下转化为乙酸，通过三羧酸循环代谢为水和CO2。ADH 能够代谢肝脏中80%的乙醇，具有重要的解酒活性[15]。有研究表明，灌胃小鼠ADH/NAD+等量混合液10 min 后再灌胃小鼠56°白酒，1 h 后ADH 表现出显著的解酒功效[16]。同时，乙醇在肝细胞可作为羟乙基自由基造成脂质的过氧化[15]，对肝细胞造成损伤。通过检测ADH 活力，可以反应肝细胞的解酒能力，也进一步评价姜黄素和玉米肽复配组对AFLD 模型细胞的保护作用。

由图8可知，200 μg/mL 姜黄素、 配方比例为1∶4 和1∶8（姜黄素∶玉米肽）均可显著提高受损肝细胞内ADH 的活力（P<0.01），ADH 活力分别是模型组的2.28 倍、1.77 倍和1.67 倍。说明玉米肽和姜黄素复配能够增强玉米肽的解酒功效。

图8 玉米肽和姜黄素对AFLD 模型细胞ADH 活力的影响Fig.8 Effect of curcumin and corn peptide on catalysis activity of ADH of AFLD model cells

3 结论

FLD 的发生涉及多方面因素，如氧化应激、代谢异常、炎症反应等，但AFLD 中乙醇引起的氧化应激损伤早在上世纪60年代就有人开始研究。关于AFLD 的治疗最主要的是戒酒，但目前关于AFLD 患者的营养干预治疗也越来越受到关注。AFLD 患者由于体内能量代谢失衡，常伴有营养失调的发生，对患者补充足够的营养物质尤为重要，其应保证每天1.2～1.5 g/kg 蛋白质的补充和35～40 kcal/kg 卡路里的摄入[4]。支链氨基酸对FALD具有很好的缓解作用，有研究表明亮氨酸对乙醇的代谢具有协同作用[9]。同时，增加维生素、姜黄素、益生菌、锌、植物抗氧化物质多酚、黄酮及优质蛋白等的摄入，均可从抗氧化和抗炎方面对缓解AFLD 方面产生一定功效[17]。本试验通过体外构建了AFLD 细胞模型，评价玉米肽和姜黄素复配对AFLD 的干预作用。以上结果表明，玉米肽和姜黄素复配能够显著降低模型细胞AST 和ALT 的分泌量，降低LDH 的泄漏量、减少MDA 的产生，提高SOD 和ADH 的活力，且均优于玉米肽单独作用组，说明玉米肽和姜黄素复配能增强玉米肽保肝解酒的功效，且从总体来说，也优于姜黄素单独作用组，可作为AFLD 患者的营养食品。