仿刺参胶原蛋白多肽对Ⅱ型糖尿病小鼠肾脏的保护机制

韩姣姣 李妍妍 周 君 芦晨阳 李 晔 张凌芷 苏秀榕*（ 宁波大学海洋学院 浙江宁波5 宁波大学食品与药学学院 浙江宁波5 阿卜杜拉国王科技大学 吉达，沙特阿拉伯王国）

仿刺参（Apostichopus joponicus），属棘皮动物门（Echinodermata）、海参纲（Holothuriodea）、盾手目动物（Aspidochirota）、刺参科（Stichopodidae）、仿刺参属（Apostichopus）[1]。近代科学研究表明，刺参体内含有丰富的营养物质，如胶原蛋白、多肽、皂苷以及微量元素等，具有多种生理功能[2-7]。仿刺参胶原蛋白和多糖主要存在于体壁中，对调控人的生理功能具有重要的意义，其主要的生理活性表现在抗氧化、抗肿瘤、抗血脂、抗血栓等。

糖尿病肾病（Diabeticnephropathy，DN）是糖尿病常见的慢性并发症之一，在糖尿病患者中20%～40%会发生肾病[8]。近年来，许多国内外的学者研究从海洋生物中提取活性成分来治疗糖尿病，如蒋鑫等[9]研究海参多糖降血脂功能，王霞等[10]研究金枪鱼胰脏酶解液对糖尿病大鼠血糖和血脂的作用。有关仿刺参多肽作为预防Ⅱ型糖尿病的研究，国内外未见报道。本文以糖尿病小鼠为对象，研究仿刺参多肽对小鼠肾脏的保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料

仿刺参取自宁波奉化博望水产养殖公司。瘦素基因敲除雄性db/db 小鼠【（36±2.0）g】30 只，雄性Db/m【（25±1.0）g】10 只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。合格证号：SCXK （沪）2007-0005（编号2007000528007），仿刺参多肽为实验室自制。总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、胰岛素浓度试剂盒，宁波美康生物科技有限公司；两性电解质、四甲基乙二胺（TEMED）、IPG 干胶条（pH 4-7）、十二烷基硫酸钠（SDS）、超纯脲，美国Bio-Rad 公司；CHAPS、30%丙烯酰胺、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺、过硫酸铵（AP）、矿物油、非干扰型蛋白浓度试剂盒，索莱宝生物科技有限公司；2-D Clean-Up Kit，美国GE 公司。其它试剂为国产分析纯级。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与饲养 10 只雄性Db/m 小鼠为空白对照组（C）；雄性db/db 小鼠30 只，按体重随机分成模型组（M），阳性药组（甲基巴多索隆CDDO-Me，9.75 mg·kg-1·d-1，ig），仿刺参多肽试验组（S，50 mg·kg-1·d-1，ig），每组10 只。空白对照组与模型组灌以等量去离子水。在试验期间，所有动物自由进食、进水，室温保持23～25 ℃，光照昼夜间隔12 h，给药时间为10 周。每天观察和记录动物的行为活动，体重变化情况每隔3 d 测定1 次。

1.2.2 生理生化指标检测 试验期10 周后停食，将小鼠麻醉后进行腹主动脉取血，分离血清，采用微板法测定血清中TC，TG，HDL-C，LDL-C 含量。试验数据用SPSS 13.0 软件进行单因素方差分析。

1.2.3 差异表达蛋白的筛选及其功能分析

1.2.3.1 蛋白质的提取及纯化 取1.0g 小鼠肾脏组织剪碎后放在预冷的研钵中加入液氮研磨成粉末，加入LB 裂解液（Alklysis buffer），使用前加入蛋白酶抑制剂（PMSF）充分溶解粉末后转移到EP管中，600 W 超声10～15 min，12 000 r/min，4 ℃离心20 min。在上清液中加入丙酮，-20 ℃沉淀过夜，12 000 r/min，4 ℃离心20 min，弃上清液，沉淀采用非干扰型蛋白质浓度测定试剂盒进行蛋白定量。

1.2.3.2 双向电泳 选择蛋白总量在200～250 μg之间，加水化上样缓冲液（7 mol/L 尿素，3 mol/L硫脲，4% w/v CHAPS，64 mmol/L DTT，0.5% v/v Bio-lyte）定容至150 μL。先将胶条从-20 ℃冰箱取出并在室温下放置1 h，将处理好的样品加入泡胀槽中，胶条轻轻覆与其上并滴加矿物油覆盖。20 ℃水化和等电聚焦12 h，平衡15 min，进行SDS-PAGE 垂直电泳。考马斯亮蓝R-250 染色、脱色、扫描，图像用PDQuest 软件进行分析以及数据处理。选择差异倍数大于1.5 倍且P<0.05 的斑点为差异蛋白，胰蛋白酶酶切后利用Autoflex speedTMMALDI-TOF-TOF（Bruker Dalton）质谱仪进行分析。利用BioTools（Bruker Dalton）软件搜索NCBI 数据库，寻找匹配的相关蛋白质。

2 结果与分析

2.1 对糖尿病小鼠血脂的影响

同空白对照组比较，模型组血清TC、TG 含量显著升高 （P＜0.01），LDL-C 含量升高 （P＜0.05），HDL-C 含量降低（P＜0.05），胰岛素浓度显著升高（P＜0.01），说明本试验造模成功。相比于糖尿病模型组，阳性药组能够降低血清TC（P＜0.01）、TG（P＜0.01）、LDL-C 水平 （P＜0.05），提高HDL-C 水平（P＜0.05），胰岛素浓度显著降低（P＜0.01）。试验组能降低血清TG（P＜0.05）、LDL-C（P＜0.05）水平，提高HDL-C 水平（P＜0.05），胰岛素浓度降低（P＜0.05），对TC 有降低的趋势，但无显著性差异。相比于糖尿病模型组，阳性药组和试验组均能显著降低LDL-C/HDL-C 比值（P＜0.01）。

2.2 差异蛋白表达的筛选及功能分析

利用双向电泳技术，分别对模型组、阳性药组和试验组的db/db 糖尿病小鼠的蛋白质表达进行了比较，其蛋白图谱如图1所示。

经双向电泳分析，共有472 个蛋白斑点可以匹配，其中对照组有150 个蛋白斑点，模型组有182 个蛋白斑点，试验组中也检测出140 个蛋白斑点。这些蛋白等电点主要集中在4～7，分子质量在10～130 ku 之间。将差异倍数大于1.5 倍以上（P<0.05）的蛋白点作为显著差异蛋白（见表2）。

表2 仿刺参多肽调控II 型糖尿病鼠肾的差异蛋白质分析Table 2 The different expression proteins on kidney of type II diabetic mice by Apostichopus joponicus polypeptide

2.3 差异蛋白的功能分析

GO 分析发现，试验组中差异表达基因富集显著的生物过程主要与蛋白转运、 激酶活性以及电子传递有关，蛋白转运过程与糖尿病之间存在某些作用，这些过程往往可以控制生物过程中关键蛋白的作用，从而影响整个生物过程。差异基因富集的分子功能过程主要与能量代谢以及激酶活性有关。糖尿病与许多基因之间存在广泛的作用，这些基因中包含一些关键代谢酶的编码序列，可以控制新陈代谢途径中关键酶的表达，从而影响整个新陈代谢[11]。差异基因富集的细胞组分中与非膜结合细胞器、大分子复合物、包外区组分相关。

2.4 差异蛋白的代谢通路分析

差异蛋白的KEGG 分析发现：这些蛋白共涉及12 条代谢通路，主要包括代谢途径、药物代谢及胰岛素抵抗等。糖尿病是一种全身代谢紊乱性疾病，一方面影响糖类代谢，导致高血糖，一方面影响脂质和蛋白质的代谢。胰岛素抵抗是导致糖尿病的重要因素，胰岛素信号通路也和糖尿病息息相关。

3 讨论

3.1 调节糖代谢

自20 世纪70年代以来，人们从海洋生物中分离出多种新型化合物，包括蛋白质类、肽类、多糖类、生物碱类等等。生物活性肽治疗效果好、副作用小，比蛋白质稳定，因此受到越来越多的关注[12]。生物活性肽不仅能为机体提供营养物质，还具有多种功能，如抗氧化、抗辐射、抗衰老、降血糖、抗菌消炎、参与机体的免疫调节等[13]，还可以降低体内血压和血糖水平[14]。徐军等[15]研究苦瓜多肽降血糖的功能。王茵等[16]研究从鱼皮中提取胶原蛋白降压肽。顾伟等[17]从大海马蛋白中提取降压肽。多肽调节血糖和血压的作用主要表现在以下几个方面，通过抗氧化、受体调节酶活性和糖代谢激素水平以及提高机体免疫力等增加糖的利用，抑制糖异生，以此来改善糖代谢和胰岛素紊乱的症状。本文的研究结果显示：仿刺参多肽能够调节糖尿病小鼠胰岛素信号通路中关键蛋白-视黄醇结合蛋白4 的表达，它一方面影响肝脏中肝糖的合成和输出，调节机体的糖代谢，一方面调节胰岛素信号通路中激酶活性和受体底物磷酸化，从而达到改善糖代谢和胰岛素紊乱的症状。

图2 试验组（S）与模型组（M）差异蛋白GO 分析Fig.2 The GO cluster analysis of different expression proteins in S：M group

图3 差异蛋白的KEGG 代谢通路分析Fig.3 The KEGG pathway analysis of the different expression proteins

图4 试验组差异蛋白参与的通路Fig.4 Differential protein pathway in experimental group

3.2 调节脂代谢

研究表明，糖尿病与血脂代谢紊乱密切相关，一般会导致血清TG、TC、LDL-C 升高同时HDL-C降低[18]，由此可引发高血压、动脉粥样化和冠心病等多种并发症[19]。本论文中的糖尿病模型组小鼠的脂代谢紊乱现象，其TC、TG、LDL-C 含量均明显高于正常对照组，HDL-C 水平显著降低。而试验组TG、LDL-C 水平均显著降低，HDL-C 水平显著升高，说明仿刺参多肽对糖尿病小鼠有调节血脂紊乱的作用。

3.3 调节胰岛素信号通路

胰岛素是调节能量代谢、 糖代谢和脂代谢的重要激素，当体内葡萄糖多余时，胰岛素通过抑制肝脏葡萄糖生成，并且促进葡萄糖分解成非糖物质，这种特异性反应使得血糖水平降低、体内葡萄糖水平保持在一个狭窄的范围内。这种稳态的机制遭到破坏后就可能导致胰岛素抵抗（IR）[20]。为了调节血糖的正常水平，机体分泌过多胰岛素，从而导致机体一系列病理变化[21]。自2005年视黄醇结合蛋白4（RBP4）被哈佛大学医学院发现以来，许多人就开始研究RBP4 在机体内的作用机制，它是一种单一肽链的蛋白质，属于Lipocalin 超家族成员，相对分子质量约为21 ku，包括181 个氨基酸残基。人类RBP4 基因为单拷贝，大小约10 kb，位于与糖尿病发生有着密切联系的染色体10 q23.3 上[22]。梁琳琅等[23]发现代谢综合征患者血清RBP4 的含量较高；Choi S[24]等研究发现妊娠期糖尿病（pGDM）妇女产后糖耐量减低的严重程度与高RBP4 水平和低脂联素水平有关。Frey S K 等[25]证实慢性肾脏疾病者血清RBP4 明显高于正常对照者。近年来研究发现RBP4 是一种新型的、特殊的循环性脂肪因子，对于胰岛素的合成与聚集具有重要作用[26]。它能够抑制肌肉组织中胰岛信号通路，并且能够促进糖异生的进行，肝糖原输出增加，导致胰岛素抵抗，进而导致糖尿病的发生[27]。本文研究结果显示，喂养仿刺参多肽的糖尿病体内葡萄糖转运蛋白表达增加，视黄醇结合蛋白4的表达下调，磷脂酰肌醇3 激酶的活性和胰岛素受体底物的酪氨酸磷酸化恢复正常，血糖水平也恢复正常，胰岛素通路正常，改善糖尿病的症状。

4 结论

仿刺参多肽可以降低糖尿病小鼠血清TC、TG、LDL-C 水平和胰岛素浓度，提高HDL-C 水平，改善糖尿病小鼠血脂紊乱的现象。同时仿刺参多肽可以使糖尿病小鼠体内视黄醇结合蛋白4 表达下调，使胰岛素信号通路恢复正常，从而达到改善糖尿病的症状。