碰碰香Plectranthushadiensis挥发油的提取及其抑菌活性初探

钟喻

摘要本研究利用水蒸馏法提取碰碰香挥发油，采取抑菌圈法对碰碰香挥发油的抑茵活性进行初探。结果表明，长有金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的培养基中均出现了比较明显的抑菌圈，证明碰碰香挥发油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有很好的抑茵效果。

关键词 碰碰香 水蒸汽蒸馏法 抑菌效果

中图分类号Q-33 文献标志码B

一般具有刺激性气味或香味的植物都含有精油，精油特别容易挥发，又称作挥发油，是存在于植物体内、能够随着水蒸气一同被蒸馏出来的油状物质的总称。精油大部分是植物体内浓缩的精华，一般由几十种甚至几百种化合物组成，在室温下为具黏稠性的、浅黄色液体，易溶于有机溶剂，不溶于水，具有杀灭细菌、消除炎症、镇定皮肤、驱除蚊虫的作用。近年来，植物精油对细菌的抑菌活性研究引起广泛的关注，许多精油都表现出良好的抑菌活性和广谱性，对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌均有很好的抑菌效果。研究表明，革兰氏阳性菌对植物精油的敏感性要大于革兰氏阴性菌，如罗勒精油和佛手柑精油对革兰氏阳性菌有很好的抑制效果。目前，国内外对植物精油的抑菌机理研究有一定的进展，主要总结为：①影响细菌细胞膜的通透性;②影响细菌细胞代谢途径;③造成DNA的损伤。

本次实验选择的实验植物是碰碰香，属于唇形科延命草属植物，又名一抹香、触留香，学名为Plectran-thushadiensisvar.tomentosus（Benth.ex E.Mey.）。茎枝为棕色，鲜嫩的茎叶呈绿色，叶片卯圆形，表面光滑，边缘有细疏的小锯齿。由于经人触碰，会散发出香味，而且香味会残留在手上，因此得名“碰碰香”。这种特殊的香味使碰碰香具有很好的观赏价值、食用价值，还有驱蚊和净化空气的效果。同时，实验以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为供试菌，运用水蒸汽蒸馏法从碰碰香叶片中提取碰碰香挥发油，初步探究碰碰香挥发油对两种细菌的抑菌活性，为碰碰香挥发油的开发利用奠定基础。

1材料与方法

1.1实验仪器及材料

实验材料：碰碰香的叶片。

指示菌菌种：标准革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）;标准革兰氏阴性菌——大肠杆菌（Escherichia coli）。以上两个菌种均为实验室的冰箱保存。

实验仪器：立式压力蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、净化工作台、电热鼓风干燥箱、旋转蒸发仪、全温度大容量振荡培养箱、电子天平、循环水真空泵、三角涂布棒、烧杯、打孔机、玻璃棒、锥形瓶、滤纸、电子天平、刻度尺、涂布棒、移液枪、酒精灯、培养皿、量筒。

主要试剂：氯化钠（分析纯）、石油醚（分析纯）、无水硫酸钠（分析纯）。

LB液体培养基：根据高中生物选修一课本中的操作步骤，制备培养大肠杆菌的常用培养基。配方为：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，氯化钠10g，蒸馏水975 mL。LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，蒸馏水960mL。将配制好的LB培养基放入立式压力蒸汽灭菌锅内，温度设置为121°C，时间设置为20min进行湿热灭菌，灭菌后将LB培养基保存在冰箱备用。

1.2实验方法及步骤

1.2.1挥发油的提取

（1）碰碰香叶片的清洗：从生长旺盛的碰碰香植株上剪下一串碰碰香叶片放入烧杯中，加入蒸馏水清洗干净，用无菌吸水纸擦干其叶片表面的水分。

（2）碰碰香叶片的干燥：将洗净后的碰碰香叶片用剪刀剪成碎片，然后置于小烧杯中，放入电热鼓风干燥箱内进行烘干，温度设置为35℃，时间为40min。烘干后的碰碰叶片置于小烧杯中备用。

（3）水蒸馏法提取碰碰香挥发油：水蒸汽蒸馏法（SD）是一种将植物和水共同蒸馏，使挥发油与水蒸气一起被蒸馏出的的提取方法，其所用溶剂是水，对人体无害，简便安全，是大部分精油的提取方法。

将烘干后的碰碰香叶片装入加有30mL蒸馏水的圆底蒸馏烧瓶，设置水浴锅的温度为70°C，打开真空泵的开关及排气阀，放入蒸馏烧瓶，关闭排气阀。再打开旋转蒸发仪，将转速调到50rmp/min，对碰碰香叶片进行蒸馏。等到圆底蒸馏烧瓶中水分快被蒸干，仅剩烘干的碰碰香叶片时，关闭排气阀以及旋转蒸发仪的开关，取下圆底蒸馏烧瓶，继续向里面加入30mL的蒸馏水，再次放入水浴锅内进行蒸馏，至获得乳白色液状的蒸馏初产物。

将蒸馏初产物与石油醚一同放入分液漏斗中进行萃取，关紧活塞并盖上分液漏斗的盖子，用力振荡后，静置40min。待分液漏斗内的液体分层后，打开分液漏斗的活塞，将下层的液体混合物倒入烧杯中。再将烧杯中的液体混合物倒入蒸馏烧瓶内，打开旋转蒸发仪的开关，用旋转蒸发仪将混合物进行多次旋蒸，温度设置为40℃，時间为1h。

1.2.2碰碰香挥发油抑菌活性研究

（1）固体培养基的制备：取灭菌后的LB固体培养基和培养皿置于超净工作台中，在酒精灯火焰附近进行倒平板操作，倒完平板后将培养皿静置，待其冷却后存放在超净工作台中，备用。

（2）菌种的纯化：从冰箱中取出金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌种，在超净工作台中将供试菌种用接种环接种到己灭菌的培养基中。将接种后的培养基放入恒温培养箱进行培养，温度为37℃，时间为24h。

（3）菌悬液的制备：用接种环挑取3～4环金黄色葡萄球菌放入盛有LB液体培养基的锥形瓶（250mL）中，后放置全温度大容量振荡培养箱37°C，叵温振荡培养24h。大肠杆菌的菌悬液制备操作同上。

（4）滤纸片的制备：采用K-B法（Kirby-Bauertest），即滤纸片法，选用质地均匀的滤纸，用打孔机打成直径5minx5mm的小圆片，灭菌后烘干。

（5）抑菌活性的测试：振荡菌悬液，用移液枪取20uL的菌悬液加入培养基，用涂布棒将其均匀涂布在平板上，静置。将滤纸片分别放入双蒸水和挥发油中浸湿，设置1组浸于双蒸水的滤纸片为对照组，3组浸于碰碰香挥发油的滤纸片为实验组，静置于超净工作台中晾干。于每个培养皿中放置4个滤纸片，并保持相互间隔一定距离，培养皿37℃倒置培养。每天观察培养皿中抑菌圈的生长情况，游标卡尺测定抑菌圈的直径，单位为mm。

2实验结果及分析

2.1挥发油提取结果

采用水蒸汽蒸馏法提取所获得的碰碰香挥发油为浅黄色油状物。该产物具有香味，容易挥发，且有一定的折光性。由于实验原材料较少，故提取出的挥发油量也十分少，只有0.85g。

产物用无水硫酸钠干燥后放于阴凉处保存。

本次探究实验采取水蒸气蒸馏法提取碰碰香挥发油，既以水为溶剂，安全无害，又使用操作方便、提取效率高的旋转蒸发仪，同时对比传统的水蒸馏装置采用酒精灯加热，温度不易控制。经旋转蒸发仪初次蒸馏后所得为乳白色、具有黏稠性的液态初产物，再次萃取、蒸馏后得到浅黄色油状终产物。鉴于精油易挥发，且本次提取量很少，及时密封保存。

2.2碰碰香挥发油对大肠杆菌的抑制作用

抑菌圈测量是对微生物进行分析的经典方法，将含有挥发油的纸片贴在接种测试菌的琼脂平板上，其少量水分使挥发油自滤纸片上溶解，并因其表面湿润而扩散，挥发油向逐渐扩散形成递减的梯度浓度，而在抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的直径大小反映测试菌对挥发油的敏感程度，抑菌圈直径的增大表明挥发油对该测试菌的抑制效果增强。本实验的结果见表1。

实验结果表明，碰碰香挥发油对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和革兰氏阴性菌大肠杆菌（Escherichia coli）均有抑菌效果。比较抑菌圈的直径大小，碰碰香挥发油对金黄色葡萄球菌的抑菌活性大于大肠杆菌。

碰碰香挥发油对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比對大肠杆菌的明显，与此前研究的结果革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌对精油更为敏感一致。此外，在实验过程中，严格遵守无菌操作规范，避免杂菌污染，否则会对实验结果产生影响。

3总结与展望

首先，初次进行探究实验时尝试传统的装置提取碰碰香挥发油，发现难以控制温度，且挥发油提取时间较长。改进实验后，选用工作温度恒定的旋转蒸发仪，操作方便，是更为理想的提取碰碰香挥发油装置。其次，由于萃取操作中使用石油醚，尽管后续步骤进行了旋蒸，但提取到的碰碰香挥发油中仍可能带有少量石油醚，可能对抑菌实验有所影响，这是本实验中所存在的不足之处。再次，本实验虽然将碰碰香的挥发油提取出来，但并未对碰碰香挥发油的成分进行具体分析，后续研究可以进一步对碰碰香挥发油的化学成分进行分离，再探究其中的有效抑菌成分及抑菌机理。最后，观察发现碰碰香挥发油对两种供试菌种的抑菌圈都比较大，并且清晰可见，可以与抗生素如阿莫西林、青霉素等进行抑菌活性的对比，为碰碰香挥发油抑菌活性的探究提供进一步的参考。