生物学实验中的标准曲线问题

余林 黄兰平

摘要对标准曲线的定义与概念进行简单的介绍，并以亚硝酸盐测定实验为例对标准曲线的各项参数分别进行说明，同时对标准曲线精度的影响因素进行了探讨，以期为高中生物相关标准曲线的教学提供参考。

关键词 标准曲线 生物学实验 亚硝酸盐

中图分类号Q944.56 文献标志码B

标准曲线是指通过测定一系列已知组分的标准物质的某理化性质，从而得到该性质的数值所组成的曲线。很多生物学实验中均需要绘制标准曲线，例如菌丝生物量的测定、酶活性的测定等。标准曲线作为一种生物学中常见的模型构建方式，对理解生物学实验中定量分析的本质、培养科学探究能力及生物学核心素养训练具有重要意义。其中浙教版《必修1.分子与细胞》中，“泡菜中亚硝酸盐测定”是典型的定量分析化学成分的生物学实验，其内含的标准曲线的制作及应用与生物学理论知识相差较远，是教学中的重点和难点，相关知识常与实验结合出现在高中生物试题当中。目前，关于高中生物实验中标准曲线的研究较多的停留在概念与绘制上面，对相关参数内涵及应用原理等的介绍鲜见报道。下面以亚硝酸盐测定实验为例对标准曲线的各项参数分别进行说明，并通过实验数据对标准曲线精度影响因素进行了具体分析，以期为高中生物相关标准曲线的教学提供参考。

1标准曲线的定义

标准曲线是直接用标准溶液制作的曲线，是用来描述被测物质的浓度（或含量）在分析仪器响应信号值之间定量关系的曲线。在分光光度法分析中，被测物质的浓度在仪器上的响应信号值在一定范围内呈函数关系，样品的测定结果通过标准曲线上查出。因此标准曲线制作的好坏，将会直接影响测定结果的准确度。生物学实验中的标准主要有两类，即吸光值（A）与浓度（C）间的A-C标准曲线和透射光强度（T）与浓度（C）间的T-C标准曲线，其中T-C标准曲线又分为方格坐标纸和半对数坐标纸。

1.1标准曲线表达式

A-C标准曲线应是一条通过原点的直线，如果坐标上各浓度点基本在一条直线上可不进行回归处理，但在实验中不可避免地存在测定误差，往往会有一、二点偏离直线，此时可用最小二乘法进行回归分析，然后绘制曲线，通常称为回归直线，而代表回归直线方程叫回归方程，表达式为y=bx+a（式中：b为直线斜率，a为截距，x为被测溶液的浓度，y为吸光度，是多次测定结果的平均值）。而T-C标准曲线是透光度关于浓度的关系。T是透射光强度（透过比色皿）与入射射光强度（还未过比色皿之前的光强度）之比。由于吸光度A=lg（1/T）=-1gT，A是透光率倒数的对数，即透-光率的负对数，只有吸光度才与浓度呈正比，所得到的透光度数值在散点图成曲线趋势时，用拟线性回归法，把原始数据转化成对数形式的数据，然后把曲线方程化为直线方程，再利用直线回归法求出直线回归方程，最后把原变量回代，就可以得到所求的曲线回归方程。浓度x与透光度T函数关系为-1gT=bx+a。

1.2关于标准曲线的选择

生物学实验中最常用的是A-C标准曲。A-C标准曲线具有绘制简单、函数关系明显等特点。但如果变量之一在所研究的范围内发生了几个数量级的变化时，则宜选择T-C标准曲线的半对数坐标纸来绘制标准曲线。在自变量由零开始逐渐增大的初始阶段，或自变量的少许变化引起因变量极大变化时，此时采用半对数坐标纸，可使曲线最大变化范围伸长，使图形轮廓清楚。

2亚硝酸盐测定中的标准曲线

按教科书所列方法，在盐酸酸化条件下，系列浓度Na2S03與对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，产物与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合生成玫瑰红溶液，利用岛津7500分光光度计测定反应溶液的吸光值（表1），结合Excel软件可以拟合出亚硝酸盐标准曲线如图1，同时得到吸光值对应亚硝酸盐浓度的函数关系。根据加有泡菜样品的反应液的吸光值，依据函数可计算出样品中的亚硝酸盐的含量，结果与国家食品安全标准进行对比，来评定泡菜的安全质量。

2.1标准曲线数值意义

根据亚硝酸盐标准曲线可得亚硝酸盐浓度与吸光度的函数关系表达式为：y=0.8872x+0.0097，其中决定系数R2的值为0.999，说明线性回归直线的拟合度较好，而在图中经过计算可得出6值为0.8872，说明不同浓度的亚硝酸钠制备的准确度会对标准曲线的准确度有较大的要求。当用扣除空白值吸光度的数值为v值进行回归时，理论上a值应为零，但实际上截距等于零的情况是很罕见的，当系统误差降到标准范围内时，随机误差总是存在的，因此截距一般不为零，若存在显著的系统误差或操作误差，测得a值较大时（1al>0.010）应找出原因后，重新绘制标准曲线。例如本研究中a的值为0.0097，说明误差较小，实验数据准确度较高。

2.2标准曲线的实验点设置

在分光光度计中，标准曲线的制作是测定结果准确与否的关键所在。所以，要设置合理的实验点数量，进行严密的实验操作，来获得一条理想的标准曲线。考虑到高中生物课程的时间限制以及学生操作能力，要控制实验点少，减少工作量，故常用实验点数n=5，但由于两端点因仪器和方法导致测定误差较大，在整个线性范围内比较可靠的实验点只有3个，因而给样品的测量值带来一定的误差，所以制作标准曲线的实验点为7个较好，例如本实验在条件允许的情况下选取8个实验点使实验数据较可靠。

2.3标准曲线的绘制

这些实验中标准曲线的绘制大多仍以传统的坐标纸法为主，这种徒手绘制的标准曲线主观性较强，实验误差较大，已经不适合现代生物学实验需要，用Excel办公软件可以快速准确地获得标准曲线，值得推广。

2.4标准曲线的精密度影响因素

2.4.1实验本身

由于亚硝酸盐含量的测定实验中显色反应较明显，所以精密度能达到较高的水平，但是也有一些实验本身原理限制了精密度。如当显色反映的灵敏度不高时，被测物低于某一浓度就不能显色，当显色溶液中的掩蔽剂或缓冲液能够络和少量被测离子，就会使标准曲线线性关系不好或不通过坐标原点，如用铬酸钡分光光度法测定水中硫酸盐，用双硫腙分光光度法测定水中锌，用离子选择电极法测定氟化物时，在标准曲线的低浓度就有可能有此现象。

2.4.2测定仪器的精密度

在进行测定前要对仪器进行校准，测定时要在最大吸收峰处测定吸光度，具体实验有不同的最大吸收峰，例如测定泡菜亚硝酸盐含量确定最大吸收峰在550nm处，要求分光光度计的有效谱带宽度较小，有利于获得纯度高的单色光，当单色光纯度不够时，测定的吸光度偏低。

2.4.3分析人员操作的影响

制作标准曲线的操作步骤中，操作控制是否精准，包括控制的pH、温度、比色时间，当空白值较高时，加液的数量与速度、振摇时间和强度、器皿洗涤、测量误差等方面控制不当，都有可能造成误差导致标准曲线的精密度不高。

3总结

教师引导学生构建标准曲线，可以让学生在科学知识的构建中同时培养自身的理性思维，科学地认识实验数据所代表的含义，感知科学技术和生产实践之间的紧密联系，提高其科学探究能力。