透骨消痛胶囊干预骨质疏松性骨关节炎模型骨重建与炎症因子变化的研究

张佳慧 李函 陈文列 陈赛楠 郑良朴 黄云梅 林薇 林如辉 黄美雅 李西海

【摘 要】目的：分析透骨消痛胶囊对骨质疏松性骨关节炎模型骨重建与炎症因子的影响，为治疗骨质疏松性骨关节炎提供依据。方法：建立骨质疏松性骨关节炎大白兔模型，取模型兔与正常对照兔各6只比较，鉴定造模成功。再将正常对照组与模型对照组大白兔各12只用生理盐水灌胃，中药组大白兔12只用透骨消痛胶囊灌胃；维持4，8周时，每组各6只取材，检测血清骨重建关键因子、骨形成与骨吸收标志物以及股骨髁炎症因子蛋白。结果：中药组与模型对照组比较，碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶和骨保护素（OPG）、破骨细胞异化因子（RANKL）活性显著降低，OPG/RANKL比值显著升高（P < 0.05或P < 0.01）；白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α显著降低（P < 0.01或P < 0.05）。结论：透骨消痛胶囊能下调过度的骨重建速率，调节异常骨代谢水平，降低炎症因子水平，改善骨关节的软骨下骨与软骨变化，延缓骨质疏松性骨关节炎进程。

【关键词】 骨关节炎；骨质疏松；透骨消痛胶囊；骨重建；骨保护素；破骨细胞异化因子；炎症因子；大白兔

【ABSTRACT】Objective：To analyze the effects of Tougu Xiaotong Jiaonang（透骨消痛胶囊）on bone reconstruction and inflammatory factors in osteoporotic osteoarthritis model，so as to provide evidences for the treatment of osteoporotic osteoarthritis.Methods：Rabbit models of osteoporotic osteoarthritis were established.Six model rabbits and six normal control rabbits were selected to identify the success of the model.Then rabbits from the normal control group（12 rabbits）and from the model group（12 rabbits）were given intragastric administration of saline.Twelve rabbits in the TCM group were given Tougu Xiaotong Jiaonang in the same way.Respectively after 4 and 8 weeks，6 rabbits in each group were taken to detect the key factorsof bone reconstruction，bone formation and bone resorption markers，and inflammatory factor protein of femoral condyle.Results：Compared with the model group，the activities of alkaline phosphatase，tartrate-resistant acid phosphatase，OPG and RANKL were significantly decreased，the ratio of OPG/RANKL was significantly increased，and the levels of interleukin-1β and tumor necrosis factor-α were significantly decreased in the TCM group.Conclusion：Tougu Xiaotong Jiaonang can decrease the rate of excessive bone reconstruction，regulate the abnormal bone metabolism and reduce the level of inflammatory factors，thereby improving the changes of subchondral bone and cartilage and delaying the progress of osteoporotic osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis；osteoporosis；Tougu Xiaotong Jiaonang（透骨消痛膠囊）；bone reconstruction；osteoprotegerin；osteoclast alienation factor；inflammatory factor；rabbits

近年研究发现，作为骨关节炎（osteoarthritis，

OA）的重要类型，绝经妇女患骨质疏松（osteoporotic osteoarthritis，OP）性OA较多，且随着年龄增长不断升高[1-2]。而我国人口老龄化问题不断加重，OP性OA势必会成为一种严重威胁国民健康的慢性疾病。但目前对OP性OA的治疗药物和相关研究较少，因此，研究OP性OA的治疗药物及机制很有必要。

OP性OA早中期主要的病理特征是软骨下骨质疏松和软骨结构损伤[3]，并伴随着炎症因子、骨代谢水平的改变[4]。通过观察骨形成标志物碱性磷酸酶（ALP）、骨吸收标志物抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）等血清骨代谢水平的变化，可了解包括软骨下骨等骨组织的新陈代谢情况及药物的治疗效果[4]。骨重建关键因子骨保护素（OPG）能够抑制破骨细胞形成[5]，而破骨细胞异化因子（RANKL）能够促进破骨细胞形成[6]。有研究表明，透骨消痛胶囊可通过作用于OPG/RANKL/RANK系统减缓骨重建速率[7]，对干预兔OA模型有良好药效[8-9]。故推测其也可通过此系统延缓OP性OA病理进程。

黄云梅等[9]研究显示，OA中软骨结构损伤加重与炎症因子水平增加有关。此外，已明确白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子参与OP的病理过程，还可诱发OP[10-11]。

因此，探讨药物对OP性OA模型中软骨结构损伤的改善作用，有必要检测炎症因子水平的变化。

前期软骨下骨微细结构与软骨显微结构的研究显示，透骨消痛胶囊干预OP性OA具有较好疗效[12]。本研究拟进一步分析透骨消痛胶囊干预OP性OA动物模型对骨代谢水平和炎症因子水平变化的作用，为进一步探索该药用于OP性OA治疗提供实验和理论根据。

1 实验材料

1.1 实验动物和药物 6月龄雌性新西兰大白兔48只，体质量1.8～2.1 kg，动物来源于上海市松江区松联实验动物场，动物合格证号CXK-（沪）2012-0011；实验在福建中医药大学实验动物中心进行，动物使用许可证号SYXK（闽）2009-0001，分笼饲养，食用标准兔颗粒饲料。透骨消痛胶囊为福建中医药大学附属第二人民医院院内制剂（闽制字Z20100006）。

1.2 主要仪器和材料 ALP、TRAP检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；ELISA试剂盒（上海西唐生物技术有限公司）；多功能酶标仪（瑞士帝肯公司，Infinite 200 PRO）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型，碧云天生物技术有限公司）；IL-1β抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）、TNF-α抗体（安迪生物科技有限公司）；超敏ECL化学发光试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；电泳仪（美国伯乐公司，PowerPac HC）；化学发光成像系统（美国伯乐公司，ChemiDocXRS+）。

2 方 法

2.1 模型制备与鉴定 首先进行OP性OA动物模型的造模实验，取12只大白兔分为模型对照组、正常对照组，每组6只。模型对照组麻醉，手术切除双侧卵巢诱导OP[7]；4周后，右侧膝关节手术诱导OA[13]；1周后，每日强迫活动30 min，维持

4周，以建立OP性OA模型。与正常对照兔比较，经Micro-CT、组织病理鉴定比较，膝关节的股骨骨质疏松，软骨损伤为OA中期，提示造模成功[3，12]。

2.2 分组、给药与取材 取36只大白兔分为模型对照组、中药组、正常对照组，每组12只。模型对照组与中药组造模方法同2.1。中药组用透骨消痛胶囊参照“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”换算以1.86 g·kg-1灌胃[14]；正常对照组与模型对照组等量生理盐水灌胃，每日1次；维持干预4周、8周时分别取材，每次每组6只。干预结束后，麻醉，腹主动脉采血；分离血清；取膝关节股骨外髁软骨与软骨下骨，置-80 ℃冰箱保存。

2.3 骨重建血清标志物检测

2.3.1 生化分析骨形成与骨吸收标志物ALP、TRAP 将血清样品用检测缓冲液稀释5倍、10倍；使用ALP、TRAP检测试剂盒；配制显色底物溶液；制备标准品工作液（0.5 mmol·L-1的p-nitrophenol液）；取96孔板按空白对照孔、标准品孔和样品孔加入检测缓冲液、标准品、血清样品及显色底物等试剂；37 ℃反应30 min，加终止液；用多功能酶标仪在405 nm处测吸光度值；据标准曲线、酶活性定义公式，计算ALP、TRAP活性。

2.3.2 ELISA测定骨重建关键因子OPG和RANKLELISA试剂盒配制标液，配制标准品液，配制洗涤液；各孔加入标准品或样品100 μL，37 ℃反应40 min；洗板4次，控干；各孔加入工作液100 μL，37 ℃反应20 min；洗板4次，控干；将酶标抗体工作液100 μL加入各孔，37 ℃反应10 min；洗板4次，控干；将底物工作液100 μL加入各孔，37 ℃暗处反应15 min；100 μL终止液加入各孔；用多功能酶标仪在450 nm处测定吸光值；计算各组OPG、RANKL值。

2.4 股骨炎症因子Western Blot分析 提取股骨外髁蛋白，用BCA蛋白定量法测定总蛋白浓度。将蛋白样本与上样缓冲液混匀，在SDS-PAGE上样孔中进行电泳，转膜；PVDF膜放入质量分数为5%的BSA中封闭3 h，再分别加入抗IL-1β、TNF-α的一抗及相应二抗4 ℃孵育过夜；TBST清洗后加入ECL发光剂显影，用蛋白化学发光凝胶成像分析系统采集图像；以β-actin作为内参，分析目的蛋白表达。

2.5 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较符合正态分布采用两样本独立t检验；不符合正态分布采用非参数检验，采用Mann-Whitney U检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 影响骨形成与骨吸收的血清ALP、TRAP变化 4周时，模型对照组ALP、TRAP活性较正常对照组显著升高（P < 0.01）。中药组干预4周、8周后较模型对照组降低（P < 0.01或P < 0.05）；与正常对照组比较，中药组干预4周后ALP活性差异无统计学意义（P > 0.05），而8周后差异有统计学意义（P < 0.05）。中药组干预4周、8周后，TRAP均较正常对照组显著升高（P < 0.01）。

见表1。

3.2 影响骨吸收抑制与促进因子的血清OPG、RANKL变化 4周时，模型对照组OPG、RANKL含量均较正常对照组显著升高（P < 0.01）。中药组干预4周、8周后均较模型对照组降低（P < 0.01）；

與正常对照组比较，中药组干预4周OPG差异有统计学意义（P < 0.01），但8周时差异无统计学意义（P > 0.05）。中药组干预4周、8周后RANKL差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

3.3 影响骨重建平衡的OPG/RANKL比值变化 4周时，模型对照组OPG/RANKL比值均较正常对照组显著降低（P < 0.01）。中药组干预4周、8周后均较模型对照组显著升高（P < 0.01）；但与正常对照组比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

3.4 影响股骨炎症因子水平的IL-1β、TNF-α变化 4周时，模型对照组IL-1β、TNF-α值较正常对照组显著升高（P < 0.01）；中药组干预4周后较模型对照组显著降低（P < 0.01）。中药组与正常对照组比较，IL-1β差异无统计学意义（P > 0.05），TNF-α差异有统计学意义（P < 0.01）。见图1、表4。

4 讨 论

中医学认为，OA、OP病位均在骨与软骨[15]，且肾主骨，肝肾两者联系紧密，故OA和OP的内因主要为肝肾不足[16]。中药透骨消痛胶囊能够补肾柔肝[17-18]，故推测该药对OP性OA也有一定作用。前期研究表明，透骨消痛胶囊可在一定程度上延缓OP性OA的病理进程[12]。本研究通过观察生化指标、炎症因子水平变化对OP性OA的影响，进一步论证透骨消痛胶囊对OP性OA的治疗意义。

4.1 透骨消通胶囊通过降低骨重建速率改善软骨下骨损伤 骨代谢水平的变化影响着骨的结构与质量。ALP能有效反映骨形成，TRAP则能反映骨吸收状况[19]。4周、8周时，模型对照组骨形成与骨吸收指标都显著增加，说明此时骨代谢水平异常提高，骨重建过度增强，骨量减少[3]；而用中药治疗后，降低了模型对照组异常升高的ALP、TRAP水平，使骨形成和骨吸收水平均下调。对于ALP而言，药物治疗4周时效果较好，与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；而治疗8周时虽能抑制异常增加的骨形成，但不能使ALP恢复至接近对照水平。对于TRAP，药物虽能抑制异常增加的骨吸收，但未使TRAP恢复至接近对照水平。故药物抑制骨吸收的作用更强，促进骨代谢平衡向骨形成方向移动，增加骨量[12]，延缓了OP性OA病理进程。这可能与中药中巴戟天多糖抗骨质疏松、川芎嗪改善微循环作用有关[20-21]。OPG/RANKL/RANK系统是调控骨重建最重要的信号通路之一[6]，当抑制骨吸收的OPG与促进骨吸收的RANKL比值升高时，骨代谢水平向正平衡移动，可诱导骨形成；反之，骨代谢向负平衡方向移动，有助于骨吸收[22]。OP性OA的软骨下骨重建异常，模型对照组OPG和RANKL含量较正常对照组均显著增加，进而使得骨形成与骨吸收异常增加，骨重建异常增强，且RANKL增加的程度大于OPG，故OPG/RANKL比值显著降低[3]，这表明骨吸收水平增加，骨代谢处于负平衡状态。但不同于通常OP模型中OPG含量降低、RANKL含量显著增加导致OPG/RANKL比值显著降低的情况[23]，而是与OA患者OPG和RANKL含量都增加的情况一致[24]。可推测OP性OA模型中，OA可能起主导作用，所以血清OPG和RANKL含量的变化与OA患者一致。

由于透骨消痛胶囊可通过调节成骨细胞OPG/RANKL表达率影响骨重建平衡[25-26]，故治疗后，异常升高的OPG和RANKL均不同程度降低，进而使得异常增强的骨形成能力、骨吸收能力均下降，骨重建异常状况改善。OPG在治疗8周时效果较好，而治疗4周抑制骨吸收能力虽下降，但不能完全使OPG恢复至对照水平；中药降低异常升高的RANKL，效果较好且接近正常对照水平。故RANKL降低的程度大于OPG，OPG/RANKL比值显著增加接近对照组，这表明骨代谢向正平衡方向移动，骨形成增加，可见中药对骨代谢平衡有重要调节作用。中药组与正常对照组比较，药物干预8周OPG、RANKL效果更好，但药物治疗4周时ALP效果较好；这可能因ALP是参与构成骨重建，而OPG/RANKL/RANK系统则是调节骨重建[6]，故ALP会先于OPG/RANKL/RANK系统出现变化。该实验提示，适当延长治疗时间对治疗OP性OA可能有一定意义。

4.2 透骨消通胶囊通过降低炎症因子水平改善软骨损伤 IL-1β和TNF-α可促进软骨细胞分泌金属蛋白酶降解软骨基质，还能抑制蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成和分泌，破坏其网状结构，从而使软骨失去黏弹性和硬度，导致软骨结构损伤且受到外力时更容易发生退变[27]；且两者具有协同作用，能够共同促进关节组织的破坏[28]，炎症因子水平越高则软骨损伤程度越严重。此外，IL-1β和TNF-α还会下调OPG/RANKL比值，影响骨重建，使得骨代谢平衡向骨吸收方向移动[5]。因此，抑制IL-1β和TNF-α被认为是防止软骨及软骨下骨破坏的有效方法。

模型对照组IL-1β和TNF-α显著升高，表明造模后软骨损伤严重；而中药组较模型对照组两者均显著降低，表明中药可有效降低异常升高的炎症因子水平，延缓软骨损伤。这可能与中药中巴戟天多糖和芍药苷等成分的苷类部位与生物碱部位发挥的抗炎作用[18，28-29]有关，还可能与肿节风、白芍调节免疫、抗炎作用[30-31]有关；且透骨消痛胶囊对TNF-α损伤的成骨细胞的增殖具有促进作用，可能具有保护骨形成免受炎症的作用[26]，故该药可能会从不同途径减轻IL-1β、TNF-α引起的炎症反应。前期已有多种动物OA模型实验证明，透骨消痛胶囊具有抑制炎症因子作用[32-33]，本实验证实该药物也能降低OP性OA模型动物炎症因子水平。

综上所述，透骨消痛胶囊能干预并延缓OP性OA的病理进程，主要通过两个方面起作用。一方面通过降低异常的骨形成、骨吸收，下调过度的骨重建速率[7]，调节骨代谢生化水平，促进平衡向骨形成方向移动，增加骨量，而改善软骨下骨结

构[12]，更好地支撑软骨；另一方面通過下调炎症因子水平，促进蛋白多糖合成分泌保护软骨，而减轻软骨损伤[12，34]。本文结合前期研究有利于从微观到宏观分析透骨消痛胶囊改善软骨下骨微细结构与软骨显微结构的作用机制[12]，进一步提示该药可在临床上扩展应用于治疗OP性OA。

致谢：感谢福建中西医结合研究院骨病研究所刘献祥教授、吴广文副研究员、吴银生副研究员对本课题的大力支持与协助！

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收稿日期：2018-09-24；修回日期：2018-11-08