隐性弓形虫感染对去势小鼠外周血雌激素水平的影响

李文梅 贾庆春 崔佳增 王猛 刘梦琪 张晨 路慧 许慧杰 刘世国

摘 要：目的：探讨刚地弓形虫感染与去势对小鼠血清激素水平的影响。方法：7周龄雌性小鼠40只，适应性饲养1周后随机分为正常对照组、去势组、刚地弓形虫感染组、刚地弓形虫感染+去势组，无菌手术摘除雌性小鼠双侧卵巢去势。F3和F4组小鼠灌胃感染弓形虫PRU株包囊。60天后采用抗弓形虫IgG抗体酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒检测血清弓形虫特异性IgG抗体、Morris水迷宫定位定航与空间探索实验检测小鼠学习及记忆能力的改变，ELISA法检测小鼠外周血雌激素水平。结果：ELISA检测小鼠血清抗弓形虫IgG抗体证实弓形虫感染组阳性率为100%。隐性弓形虫感染的去势小鼠外周血性雌激素水平较去势小鼠外周血雌激素水平显著升高（P<0.05）。感染组小鼠外周血雌激素较正常对照组小鼠外周血雌激素水平显著升高（P<0.05）。结论：隐性弓形虫感染能使去势小鼠外周血雌激素水平升高。

关键词：去势 弓形虫 外周血雌激素水平

中图分类号：Q-06 文献标识码：A 文章编号：1003-9082（2019）04-0-01

弓形虫是人和温血类动物常见细胞内感染寄生原虫，其慢性感染可导致动物及人类思维和行为改变[1，2]。外周血性激素水平的恒定是机体生理机能及思维活动正常的根本基础，性激素水平下降与脑功能状态密切相关[3-5]，而思维迟缓，焦躁、抑郁、和学习记忆功能减退是弓形虫感染的重要临床特征[6，7]。本研究设计了去势动物模型，探讨隐性弓形虫感染对去势小鼠外周血雌激素水平的影响。

一、材料与方法

1.实验动物分组

NIH小鼠，健康，清洁级，8周龄雌小鼠40只，体重（20±2）g，购自河南新乡华兰生物，常规饲养。小鼠随机分为正常对照组、去势组、感染组、去势+弓形虫感染组，每组各10只。适宜性饲养1周后行去势手术。术后一周用灌胃予以感染组和去势+感染组含有弓形虫包囊（4～5只包囊）的生理盐水0.2ml，正常对照组和去势组予以生理盐水。

2.试剂

戊巴比妥钠与抗弓形虫IgG抗体酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒，雌二醇试剂盒购自江莱生物公司。

3.仪器

分析天平，鼠称，电热控温烤箱，医用手术剪，医用镊子，医用手术刀，水迷宫。

4.实验方法

4.1去势小鼠模型建立

1%戊巴比妥钠（0.35ml/Kg）麻醉后小鼠，腹位固定，取背部中线下1/3处两侧切口，剪除长毛，沿背部后正中线作一长约0.5-1.0cm的皮肤切口，查找小鼠左右双侧卵巢，结扎血管，行卵巢切除术。

4.2慢性弓形虫感染去势小鼠模型建立

每只去势小鼠经口灌胃方法感染弱毒株刚地弓形虫包囊4～5只。弓形虫感染2月后采集尾部血液，ELISA方法检测血液抗弓形虫抗体。

4.3小鼠行为学实验

在去势60天后，在水迷宫实验环境下饲养2d，训练在每天上午8：00～19：00间进行。将Morris水迷宫均分为4个象限（水温21℃），平台放入其中1个象限中，没入水面1cm。小鼠自第1象限面向池壁入水，视频跟踪并记录找到平台所需时间（潜伏期）。允许在60s内找到平台，找到后在平台上保持10s。若60s内找不到，则引导小鼠到平台上保持10s。按照上述方法每天每只小鼠在4个象限依次训练一次。5d后撤掉平台进行探索试验，记录小鼠300s内跨越平台的次数。

4.4外周血雌激素检测

小鼠断尾取血0.25ml，按试剂盒说明进行雌激素水平检测。

5.统计分析

采用SPSS13.0软件，所有数据用采用均数±标准差（X±S）表示，各组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.慢性弓形虫感染对去势小鼠定位定航能力的影响

ELISA检测小鼠血清抗弓形虫IgG抗体证实弓形虫感染组阳性率为100%。Morris水迷宫实验结果显示，去势组逃避潜伏期较正常对照组延长，感染组和去势+感染组小鼠的潜伏期均较对照组缩短，差异具有统计学意义（P<0.01）。

2.四组小鼠血清性激素水平比较

去势+感染组的雌激素水平较对去势组升高，差异有统计學意义（p<0.05），感染组的激素水平较对照组明显升高，差异有统计学意义（p<0.05）。

三、讨论

弓形虫以人类和动物为中间宿主，猫和其他猫科动物是弓形虫的终宿主，人类后天感染多因摄入带有弓形虫包囊的肉类或有卵囊污染的水源所致。雌二醇（E2）保护神经系统，促进突触重塑及神经生长，并调节各种和认知相的突触标记物，增加基底前脑和海马中的胆碱乙酰转移酶活性，促进神经营养因子的表达的功能[8，9]。雌二醇可能可以调节BDNF的转录[8]。通过水迷宫实验发现去势小鼠逃避潜伏期延长，说明雌激素下降或缺失影响小鼠的记忆认知功能，感染弓形虫初期小鼠逃避潜伏期缩短，小鼠雌激素却升高，证实了雌激素通过调节脑部与学习、记忆、行为相关因子从而影响脑的功能状态，但是后续研究发现随着弓形虫感染时间延长，感染及去势感染小鼠水迷宫逃避潜伏期都明显延长，说明弓形虫慢性隐性感染影响脑的功能状态。本研究应用通过建立去势动物感染弓形虫模型探讨雌激素水平下降或缺失状态下隐性弓形虫感染对外周血性激素水平的影响，为雌激素下降或缺失情况下慢性、隐性弓形虫感染对机体脑功能的改变提供理论基础。

参考文献

[1]Zhenggang Xiong，Peter W.Laird.COBRA：a sensitive and quantitative DNA methylation assay[J].Nucleic Acids Research，1997，25（12）：2532–2534.

[2]Bosquiazzo V L， Ramos J G，Varayoud J.Mast cell degranulation in rat uterine cervix during pregnancy correlates with expression of vascular endothelial growth factor mRNA and angiogenesis[J].Reproduction，2007，（133）：1045–1055.

[3]Emilia R，Federica D，Angelis L，etc.Nicotine exposure during adolescence：cognitive performance and brain gene expression in adult heterozygous reeler mice[J].Psychopharmacology，2014（231）：1775–1787.

[4]Andrea F，Vincenzina N，Rosaria A.B-vitamin deprivation induces hyperhomocysteinemia and brain S-adenosylhomocysteine， depletes brain S-adenosylmethionine， and enhances PS1 and bace expression and amyloid-β deposition in mice[J].A.Fuso et al./Mol. Cell. Neurosci，2008， （37）：731–746.

[5]Marija Kundakovic，Ying Chen， Erminio Costa. DNA Methyltransferase Inhibitors Coordinately Induce Expression of the Human Reelin and Glutamic Acid Decarboxylase 67 Genes[J].Molecular Pharmacolgy，2007，（71）：644–653.

[6]Sophie La Salle，Carmen Mertineit， Teruko Taketo.Windows for sex-specific methylation marked by DNA methyltransferase expression profiles in mouse germ cells[J].Developmental Biology ，2004，（268）：403 – 415.

[7]Jaroslav Flegr，Jan Havlícek，Petr Kodym. Increased risk of traffic accidents in subjects with latent toxoplasmosis： a retrospective case-control study[J].BMC Infectious Diseases，2002，（2）：11

[8]OY Kusbeci，Miman， M Yaman.OC.Could Toxoplasma gondii have any role in Alzheimer disease[J].Alzheimer Disease & Associated Disorders，2011，25（1）：1.

[9]Prandovszky E，Gaskell E，Martin H.The neurotrophic parasite Toxoplasma gondii increases dopamine metabolism[J]. PLoS One， 2011，6： e23866.

作者簡介：李文梅（1985-），女，河南青海互助人，新乡医学院基础医学院，主要从事基础检验教学工作。崔佳增，新乡医学院2017级研究生。贾庆春，新乡医学院2015级本科生。刘世国，新乡医学院分子病原体研究室。