抗结核急性药物性肝损伤患者GCLM、GCLC和GSTP1基因多态性的关系

王赟 鲍靖

肺结核是我国常见的传染病之一，临床常采用多种抗结核药物治疗，但患者易出现抗结核急性药物性肝损伤(anti-tuberculosis acute drug-induced liver injury，AADLI)，严重时可导致患者出现急性肝衰竭甚至死亡[1]。目前关于AADLI的诱因尚未完全清楚，有研究认为与药物毒性代谢酶及转运蛋白等的基因多态性有关[2]。谷氨酰半胱氨酸连接酶修饰亚基(GCLM)基因C-588T位点多态性可影响GCLM活性进而参与多种生理病理过程[3]，谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)T-129C位点可通过影响抗氧化物水平进而参与慢阻肺疾病发生及发展过程[4]，谷胱甘肽S转移酶P1(GSTP1)可促使亲电子物质与谷胱甘肽继而与亲脂性细胞毒药物结合并降低药物作用[5]。本研究主要探讨GCLM、GCLC、GSTP1基因多态性与AADLI的关系，为临床用药和降低肝损伤发生率提供参考。

资料与方法

一、一般资料

选取2016年6月至2017年2月在青海省第四人民医院确诊为肺结核患者178例，所有肺结核患者均符合诊断标准[6]。出现抗结核急性药物性肝损伤患者92例为研究组，均符合抗结核药物性肝损伤诊断标准[7]，其中男68例，女24例，年龄42～68岁，平均(49.2±15.8)岁。未出现抗结核急性药物性肝损伤患者86例为对照组，其中男56例，女30例，年龄41～70岁，平均(48.7±16.6)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：①抗结核治疗不少于6个月；②均使用相同抗结核治疗方案；③无服用其他可引起肝功能异常药品；④临床资料完整；⑤患者知情且签署同意书。排除标准：①其他原因所致肝功能严重损伤；②病毒性肝炎或酒精性肝炎；③自身免疫性疾病；④患者依从性差；⑤多种组织器官缺氧性损伤。

二、方法

采集受试者静脉血3 mL置于EP抗凝管内，2 000 r/min离心3 min，加入红细胞裂解液混匀，-20 ℃保存。提取基因组DNA并采用限制性片段长度多肽法(RFLP)进行检测，DNA提取试剂盒(购自北京天根生化科技公司)提取全血基因组DNA，GCLM、GCLC、GSTP1基因分型采用PCR结合RFLP方法并运用Sequenom软件进行SNP基因分型(Nano Drop2000c核酸检测仪购于美国Thermo公司，PCR扩增仪购自美国BioRad公司)，GCLM基因T-588C、GCLC基因C-129T位点T、GSTP1基因Ile105Val位点PCR扩增、单碱基延伸引物由广州Invitrogen公司合成。PCR反应体系共50 μl，Taq Buffer 5 μl，MgCl23 μl，位点T、G(A、C)引物上下游各2 μl，dNTP Mix 1 μl，DNA样本4 μl,Taq DNA 0.5 μl，H2O 28.5 μl。PCR反应条件为95℃ 53 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环，72℃延伸7 min。取PCR产物5 μl并加入20 μl酶切反应体系，进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察电泳条带，各基因型判断参照相关文献[8]，回收PCR产物经上海生工生物公司进行序列测定。GCLM基因T-588C位点：①野生型CC型，两条DNA条带，200 bp、84 bp；②突变杂合子CT型，两条DNA条带，200 bp、129 bp；③突变纯合子TT型，一条DNA条带，129 bp。GCLC基因C-129T位点：①野生型纯合子TT型，一条DNA条带，163 bp；②突变杂合子CT型，两条DNA条带，163 bp、137 bp；③突变纯合子CC型，一条DNA条带，137 bp。GSTP1基因Ile105Val位点：①野生型纯合子AA型，一条DNA条带，452 bp；②突变杂合子AG型，两条DNA条带，452 bp、222 bp；③突变纯合子GG型，两条DNA条带，230 bp、222 bp。

三、观察指标

ALT、AST、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、TBil、白蛋白、血清C反应蛋白(CRP)。

四、统计学方法

结 果

一、两组一般资料比较

研究组ALT、AST、γ-GT、TBil与CRP水平均显著高于对照组(P<0.05)，而白蛋白水平显著低于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 2组患者肝功能指标比较(±s)

二、GCLM、GCLC与GSTP1基因分型

GCLM、GCLC与GSTP1电泳条带结果见图1。GCLM基因T-588C位点存在单核苷酸多态性即C→T，CC为野生型、CT为突变杂合子、TT为突变纯合子；GCLC基因C-129T位点存在单核苷酸多态性即T→C，TT为野生型、CT为突变杂合子、CC为突变纯合子；GSTP1基因Ile105Val位点存在单核苷酸多态性即A→G，AA为野生型、AG为突变杂合子、GG为突变纯合子。

注：1-3分别为GCLM基因T-588C位点CC、CT、TT基因型；4-6分别为GCLC基因C-129T位点TT、CT、CC基因型；7-9分别为GSTP1基因Ile105Val位点AA、AG、GG基因型

三、Hardy-Weinberg遗传平衡验证

研究组与对照组Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验结果显示GCLM、GCLC与GSTP1基因位点实际值与预测值比较无明显差异(P>0.05)，且各基因型频率稳定，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，见表2。

四、AADLI与GCLM、GCLC、GSTP1基因多态性及其相关因素的Logistic分析

将影响AADLI发生的影响因素与GCLM、GCLC、GSTP1基因多态性进行Logistic分析，结果显示γ-GT、CRP水平及GCLM基因T-588C位点TT、GCLC基因C-129T位点CC、GSTP1基因Ile105Val位点GG基因型均为AADLI发生的危险因素，见表3。

讨 论

药物性肝损伤主要是由于抗结核治疗药物及其代谢产物对肝细胞代谢产生干扰作用，并对肝细胞产生毒性及免疫变态反应，同时可对患者抗氧化应激能力产生重要影响，严重时可导致患者出现AADLI甚至危及生命[9]。研究发现HBV携带者发生药物性肝损伤的概率更高，并促使药物清除率降低进而加剧药物毒性反应[10]。近年来抗结核药物所致肝损伤已成为我国AADLI发生的主要因素，及时干预是减少其发生的关键[11]。

表2 GCLM、GCLC、GSTP1基因型频率实际值与预测值的比较 [例(%)]

注：a为研究组比较；b为对照组比较

表3 AADLI与GCLM、GCLC、GSTP1基因多态性及其相关因素的Logistic分析

谷胱甘肽(GSH)可调节细胞氧化还原状态进而降低机体氧化损伤程度，而谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)为GSH的限速酶并对其合成过程产生重要作用[12]。GCL主要由GCLC与GCLM组成，其中GCLC具有催化活性而GCLM具有调节功能[13]。研究表明GCLC与GCLM基因单核苷酸多态性改变可调控基因表达过程从而参与多种疾病的发生过程[14]。GCLM(T-588C)突变基因型可决定启动子活性，并与慢性阻塞性肺疾病易感性密切相关[15]。GCLC(C-129T)突变基因可通过改变核蛋白结合域构象并阻碍氧化应激或免疫反应等元件与其结合进而抑制GCLC基因表达，同时可减少GSH生成并削弱细胞抗氧化应激或免疫能力最终增加发病风险[16]。本研究结果显示，GCLM、GCLC基因位点实际值与预测值比较无明显差异且各基因型频率稳定，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，GCLM基因T-588C位点C→T，GCLC基因C-129T位点T→C。进一步分析发现研究组与对照组GCLM基因T-588C位点TT基因型分布比较差异显著，GCLC基因C-129T位点CC基因型分布比较差异显著，说明GCLM基因T-588C位点TT基因型与GCLC基因C-129T位点CC基因型可抑制GCLM及GCLC基因表达并参与AADLI发生过程，提示GCLM与GCLC基因多态性可通过调控相关基因表达，并影响GSH生成进而调节机体氧化应激反应等生理病理过程，最终影响AADLI发生及发展。

谷胱甘肽S转移酶(GST)是人体内一种重要的Ⅱ相药物代谢酶且属于解毒酶系，其基因多态性可通过改变酶分子结构、功能及表达水平从而影响细胞解毒能力，其与肿瘤易感性密切相关[17]。GSTP1基因定位于人类染色体11q13，GSTP1基因Vall05位点A→G突变可影响GSTP1酶活性并与非小细胞癌药物化疗效果有关[18]。GSTP1 Ile105Val位点单核苷酸多态性与肺癌、乳腺癌等易感性密切相关并可影响多种化疗药物敏感性[19]。本研究结果显示，GSTP1基因Ile105Val位点主要以AA纯合子为主，突变纯合子GG基因型较少，但仅GG基因型在研究组与对照组中分布差异显著，与文献报道相似[20]。说明GSTP1 Ile105Val基因型突变可影响肺结核患者发生AADLI，提示携带GG基因型肺结核患者发生AADLI危险性增加。多因素Logistic回归分析结果显示，γ-GT、CRP水平及GCLM基因T-588C位点TT基因型、GCLC基因C-129T位点CC基因型、GSTP1基因Ile105Val位点GG基因型均为AADLI发生的危险因素。本研究结果揭示GCLM基因T-588C、GCLC基因C-129T及GSTP1基因Ile105Val位点突变会影响GSH与GCL活性，降低代谢药物能力，进而增加AADLI患者易感性。

综上所述，GCLM、GCLC与GSTP1基因多态性与AADLI发生密切相关，可能作为早期AADLI发病风险的重要指标，但其在AADLI发病过程中的具体作用机制有待深入研究。