高大山羊草 Pm13染色体片段对小麦农艺和产量性状的影响

郭 军，李家前，2，李豪圣，王灿国，刘爱峰，程敦公，曹新有，刘建军，赵振东，宋健民

(1.山东省农业科学院作物研究所/小麦玉米国家工程实验室&农业部黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室，山东济南 250100；2.鲁东大学，山东烟台 264025)

小麦是我国的重要粮食作物之一。随着我国人口数量不断增加，小麦需求将持续增长。据预测，2020年我国小麦需求量将达到1.4亿～1.5亿吨，小麦产量须在现有基础上每年递增1.4%，才能保障国家粮食安全[1]。此外，白粉病是小麦最重要的叶部病害之一，可造成小麦产量损失5%～40%[2-3]，位列植物真菌十大病害第六位[4]。因此，培育抗白粉病小麦品种对于保障粮食安全具有重要意义。

高大山羊草(Aegilopslongissima，2n = 14，SlSl)是小麦的近缘植物，含有抗旱、优质、抗白粉病等优异基因，是小麦遗传改良的重要基因源[5]。研究人员从高大山羊草中鉴定出一个新的小麦抗白粉基因，位于高大山羊草3Sl染色体短臂上，并命名为抗白粉病基因Pm13[6]，它是一个广谱抗性基因，能够有效抵抗小麦白粉病菌侵害[7-8]。基于高大山羊草3Sl染色体与小麦3A、3B和3D染色体同源，利用ph1b介导的部分同源重组，创制了小麦-高大山羊草Pm13短片段易位系R1A、R1B、R4A、R5A、R6A、R2A、R2B和R1D。RFLP分析结果表明，易位系R1A、R1B、R4A、R5A、R6A为3B-3Sl易位，其他易位系为3D-3Sl易位[9-10]。根据高大山羊草特异RFLP标记，开发了与Pm13紧密连锁的SCAR分子标记，并利用这些分子标记对3B-3Sl和3D-3Sl易位系分析发现，在5个3B-3Sl易位系中，R1B中外源染色体片段最小，R6A中外源染色体片段最大；在3个3D-3Sl易位系中，R2B中外源染色体片段最小，R2A中外源染色体片段最大。根据分子标记在染色体的遗传位置，探明R1B中外源染色体片段最小[11]。

外源优异基因导入小麦后，往往伴随不利的影响，如长穗偃麦草抗叶锈病基因Lr19与高黄色素含量基因连锁[35]。Pm13导入小麦是否对小麦农艺、产量等性状有不利影响，目前并未见相关报道。本研究拟利用创制的RIL群体，分析高大山羊草染色体片段对小麦农艺和产量性状的影响。

1 材料与方法

1.1 植物材料

高抗白粉病小麦材料R1B及高感白粉病小麦品种济麦22均系本实验室保存。以抗白粉病小麦R1B为父本，以高感白粉病小麦品种济麦22为母本，配制杂交组合。其杂种F1自交得到F2，F2单株连续自交3次，构建RIL群体，其包括69个F2∶5家系，对F2∶5家系进行抗病性鉴定，高感普通小麦品系山农7064作为感病对照材料。R1B为Pm13的载体品种[11]。

1.2 成株期白粉病抗性鉴定

将R1B、济麦22以及RIL群体于2017年10月种植于山东省农业科学院作物研究所试验基地，每个材料种植2行，每行30粒，行长1.5 m，行距33 cm，每20行种植感病亲本济麦22和感病对照山农7064，田间自然诱发发病。发病前20 d(4月上旬)灌溉1次，以确保田间湿度。待感病亲本济麦22和感病对照山农7064完全发病后，于小麦灌浆期，每行随机选择10株调查白粉病抗性。抗病性调查参照文献[12]，记载反应型：0级为免疫，1级为高抗，2级为中抗，3为中感，4级为高感。根据反应型，对RIL群体各株系进行分类，分为抗病株系(反应型0～2)和感病株系(反应型3～4)。

1.3 分子标记检测

于小麦三叶期，取幼嫩叶片,利用CTAB法提取基因组DNA,具体方法参考文献[13]。利用与抗白粉病基因Pm13紧密连锁的分子标记Xutv14(F:CGCCAGCCAATTATCTCCATGA;R:AGCCATGCGCGGTGTCATGTGAA)对上述RIL群体及其亲本进行基因型分析,PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系体积为15.0 μL,包括10 × Buffer 缓冲液1.5 μL、2.5 mM dNTP 溶液1.2 μL、Taq 酶0.15 μL、灭菌双蒸水8.15 μL、50 ng DNA 模板2.0 μL及前引物和后引物 各1.0 μL。PCR扩增程序为95 ℃预变性5 min;35 个循环(94 ℃变性50 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。PCR扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳分析,EB染色,Bio-Rad凝胶成像仪成像。

1.4 农艺性状调查

于小麦开花期和灌浆期，参照中华人民共和国农业行业标准《农作物品种区域试验技术规程-小麦》对抽穗期、开花期、株高、穗长、穗粒数等性状进行调查分析，每个材料调查30穗。收获后，利用万深SC-G自动种子考种及千粒重分析仪对RIL群体进行分析，获取千粒重、粒长、粒宽、粒周长等参数，每个材料至少分析500粒。

1.5 数据分析

根据基因型和表型鉴定结果，将RIL群体分为2类：抗白粉病组(R组)和感白粉病组(S组)。利用Microsoft Excel 2003 对两类材料间抽穗期、开花期、千粒重等12个农艺和产量性状进行T检验分析；利用ImageGP软件(http://www.ehbio.com/ImageGP/)绘制小提琴图、抖动图和箱型图，利用Photoshop CS 4.0对图片进行处理。

2 结果与分析

2.1 抗白粉病鉴定与分子标记分析

2.2 高大山羊草染色体片段对小麦农艺和产量性状的影响

T检验结果(表1和图3)表明，RIL群体中，抗白粉病株系和感白粉病株系间株高、抽穗期、开花期、穗粒数、粒长、粒宽、粒周长、穗长、每穗可育小穗数、每穗不育小穗数、千粒重和粒长宽比差异均不显著(P>0.05)。这说明高大山羊草染色体片段对小麦农艺和产量性状无明显不利影响。

A：R1B；B：济麦22；C～F：4个抗病RIL株系，分别为JMP001、JMP003、JMP005和JMP007；G～J：4个感病RIL株系，分别为JMP002、JMP009、JMP022、JMP027。

1：R1B；2：济麦22；3～6：4个抗病RIL株系；7～10：4个感病RIL株系。

3 讨 论

表1 调查的12个农艺和产量性状Table 1 Agronomic and yield-related traits investigated in this study

图3 调查的12个性状在R组和S组中的波动范围

外源染色体导入普通小麦后，一方面引入了抗病、抗逆、优质等优异基因，另一方面也将一些不利性状带入。长穗偃麦草抗叶锈病基因Lr19抗性强，在小麦抗病育种显示出巨大的应用潜力，但是其与高黄色素基因连锁，限制了其在小麦遗传改良中的应用[25-26]。黑麦1RS染色体导入普通小麦品种后，提高了抗病性、穗粒数、穗重，同时将降低小麦品质的黑麦碱引入[27-31]。因此，在小麦远缘种基因的利用过程中，在创制小麦-近缘植物染色体短片段易位系的同时，也要开展外源染色体片段对小麦农艺、产量和品质性状的影响研究[32-34]。本研究利用RIL群体分析了高大山羊草Pm13染色体片段对小麦抽穗期、千粒重等农艺和产量性状的影响，结果表明，抗白粉病组(R组)和感白粉病组(S组)间，所有调查的12个性状均无显著差异(T检验)，说明Pm13对抽穗期、开花期、千粒重等农艺和产量性状没有明显不利影响。因此，在今后小麦抗病遗传改良中，应配制更多含有该基因的杂交组合，培育抗白粉病品种，发挥其在小麦生产上的利用价值。