45份小麦种质赤霉病抗性评价与农艺性状分析

徐乔乔，李巧云，牛吉山，于东艳，段宗彪，梁晓龙，焦志鑫

(河南农业大学国家小麦工程技术研究中心/河南省粮食作物生理生态与遗传改良重点实验室，河南郑州 450002)

小麦赤霉病(Fusarium head blight of wheat, FHB)主要由禾谷镰刀菌(FusariumgraminearumSchw.)侵染引起，该病菌可侵染小麦苗、叶、穗等部位，引起苗腐、茎基腐、穗枯等，是温暖潮湿地区常见的重要小麦病害[1-2]。小麦赤霉病除引起小麦产量、籽粒品质和商用价值降低外，病原菌产生的真菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)等严重影响人和动物的健康[3-4]。我国小麦赤霉病由长江中下游地区向黄淮麦区蔓延，发病面积日渐扩大，对国内小麦生产和粮食安全带来严重威胁[5-7]。培育抗赤霉病品种是防治小麦赤霉病危害最经济、有效的方法。然而，小麦对赤霉病的抗性属于数量性状遗传，受环境和遗传因素的影响，抗病性复杂[8]，且缺乏抗赤霉病的小麦资源。小麦赤霉病侵染主要在花期，抗病性鉴定受时间限制，对小麦抗赤霉病育种有一定的影响[9-10]。

目前，已鉴定出与小麦赤霉病抗性相关的QTL(quantitative trait loci)200多个[11]。其中，SSR(simple sequence repeats)标记 Xbarc147、Xgwm493和Xgwm 533等与抗赤霉病的主效QTL基因Fhb1连锁[12-16]。近些年，这些分子标记已经用于小麦抗赤霉病育种工作中，但至今尚未见利用这些主效QTL培育成生产上推广品种的报道。本研究以F.graminearum菌株F15为供试菌，采用微量移液器进行单花滴注接种的方法，以国家小麦工程技术研究中心小麦遗传育种课题组的小麦品系09X15作为感赤霉病对照，对从南京农业大学等七家单位收集的45个小麦材料进行赤霉病的抗性鉴定与农艺性状调查，并利用分子标记检测这些材料携带Fhb1基因的情况，以期获得农艺性状较好且高抗赤霉病的小麦种质资源，加快抗赤霉病株系的选育进程。

1 材料与方法

1.1 试验材料及田间种植

供试的45个小麦材料收集自南京农业大学、山东农业大学、四川农业大学等七个单位，其中，苏麦 3 号用作抗赤霉病对照，09X15(高产)用作感赤霉病对照，具体信息见表1。

供试的禾谷镰孢菌(F.graminearum)株F15由南京农业大学马正强教授惠赠。

小麦材料于2014-2015、2015-2016与2016-2017三个小麦生育期(下简称2015、2016与2017)在河南荥阳市豫龙镇试验田种植。三次重复，随机排列。每个材料种植一行，每平方米种植195粒，行长1 m，行距20 cm。试验田的管理如施肥、除草、灌溉及虫害防治同常规育种田。

1.2 赤霉病抗性鉴定

采用微量移液器进行单花滴注接种。在小麦始花期，于下午4点以后，每个重复选取10个单穗，每穗选中部1个小花注射F15孢子悬浮液10 μL，分生孢子悬浮液的浓度为5×105· mL-1，套袋保湿 3 d。接菌21 d后调查发病小穗数与总小穗数，并计算发病小穗率(percentage of diseased spiklet, PDS)。

参照国家农业行业标准(NY/T 1443.4-2007)进行小麦抗赤霉病抗性评价。小麦赤霉病严重度分为 5 个等级：0 级(接种小穗无可见发病症状)，1 级(小穗发病或相邻个别小穗发病，病斑不扩展到穗轴)，2 级(穗轴发病，病小穗率<1/4)，3 级(穗轴发病，病小穗率1/4～1/2)，4 级(穗轴发病，病小穗率>1/2)。小麦赤霉病抗性分为 5 个等级：免疫(I，X=0)，抗(R，0

1.3 Fhb1基因的检测

1.3.1 基因组DNA提取

小麦基因组DNA的提取参照 Saghai-Maroof 等[17]报道的 CTAB 法进行，DNA干燥后溶于 TE 缓冲液，4 ℃贮存备用。

1.3.2 分子标记检测

与Fhb1基因连锁的三个SSR标记 Xgwm493、 Xgwm533和Xbarc147检测参照文献[16]，目的条带大小分别为210 bp、140 bp、120 bp，以苏麦 3号为阳性对照，09X15 为阴性对照。PCR 反应体系为 10 μL，含5.0 μL 2×M5 Taq PCR Mix，上、下游引物(浓度均为10 μmol·L-1)各 0.4 μL，1.0 μL 模板 DNA(50 ng·μL-1)，ddH2O补足至 10 μL。PCR 扩增程序：94 ℃ 预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，56/60 ℃退火 30 s(Xgwm493和Xgwm533退火温度为60 ℃、Xbarc147退火温度为56 ℃)，72 ℃延伸 30 s，35个循环；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保存。

表1 45 份小麦材料2015-2017年的赤霉病抗性田间鉴定评价Table 1 Evaluation on resistance of 45 wheat germplasm to Fusarium head blight based on field tests from 2015 to 2017

-:数据丢失。-：Missing data.JAAS：Jiangsu Lixiahe Agricultural Science and Technology Institue.

PCR 产物用8%(w/v)的非变性聚丙烯酰胺凝胶，在1倍TBE缓冲液500 V电泳70 min，银染后照相观察并记录。

1.4 农艺性状测定

分蘖能力与抗冻性：参照中华人民共和国农业行业标准(NY/T 1301-2007)测定。

株高：开花期每个材料取10株测量主茎高度，取平均值。

穗长、小穗数、穗粒数、千粒重调查：小麦收获期每个材料每重复选10株的主茎穗，测量穗长、小穗数、穗粒数、小穗密度(单穗的小穗数/穗长)；小麦收获晾干后测千粒重。

2 结果与分析

2.1 供试材料的赤霉病抗性

从表1可以看出，45份小麦材料中，共有13个材料表现抗赤霉病，其中，4个材料(NMAS001、宁麦9号、网93、苏夫)在2015、2017生长季表现为抗病，1个材料(15HN018)在2016、2017，1个材料(NMAS020)在2015、2016生长季表现抗病，7个材料(15HN200、苏麦3号、15HN042、H35、N553、望水白、P48)连续三年均表现为抗病。感病品系09X15三年的发病小穗率均大于87%。

2.2 Fhb1位点的分子检测

用SSR标记Xgwm493、Xgwm533、Xbarc147 检测45个小麦材料携带Fhb1的结果(表2)表明，有20个材料的三个分子标记检测结果均为阳性。在13个表型鉴定为抗病的小麦材料中，有9个材料(NMAS001、NMAS020、望水白、苏麦3号、P48、宁麦9号、网93、苏夫与N553)用三个标记均扩增出目的条带，有4个材料(15HN018、15HN200、15HN042与H35)扩增出一或两个标记的目的条带。在三个分子标记检测均为阴性的9个小麦材料(09M20、10M10、节燕2000、PIC447、11-267、L658、L699、09X15、Tybalt)中，2个(节燕2000和PIC447)表型鉴定在2015年表现中抗(图1，表2)。

2.3 农艺性状表现

45个小麦材料的农艺性状调查结果(表3)表明，表型鉴定为抗病的13个小麦材料的主要农艺性状大多表现不良，NMAS001、NMAS020、望水白、苏麦3号、P48、H35、N553 共7个材料的株高较高，均在1m以上； NMAS020、苏夫和N553

表2 45个小麦材料 Fhb1位点的分子检测Table 2 Detection of the major gene Fhb1 resistance to Fusarium head blight in the 45 wheat germplasm

1:阳性；0:阴性。

1:Positive; 0:Negitive.

A:分子标记 Xgwm493；B:分子标记Xgwm533；C:分子标记Xbarc147；黑色箭头所指为目标条带；M:DNA分子量标记；1:阳性对照(苏麦3号)；2:阴性对照(09X15)；条带3～47依次对应编号YP 1～45的小麦品种(系)(表1)。

表3 赤霉病抗性较好的 13 个小麦材料的主要农艺性状Table 3 Main agronomic traits of 13 wheat germplasm resistance to Fusarium head blight

TGW:Thousand grain weight; SD:Spikelet density.

3个材料的抗冻害能力不强；苏麦3号、P48、网93和15HN042共4个材料的抗倒伏性较弱；除小麦品系15HN042外，其他材料的小穗密度都较低。综合农艺性状和抗病性，以15HN018、15HN200和宁麦9号为较优选择。

3 讨 论

本研究用微量移液器进行单花滴注接种鉴定的方法，连续三年对收集于7个单位的45个小麦材料进行了赤霉病抗性的表型鉴定，共筛选出来13个抗病材料(NMAS001、宁麦9号、网93、苏夫、15HN018、NMAS020六个材料在两年表现抗病，15HN200、苏麦3号、15HN042、H35、N553、望水白、P48七个材料连续三年表现抗病)。用抗赤霉病主效QTLFhb1连锁的三个SSR标记 Xgwm493、Xgwm533、Xbarc147检测，13个抗病的小麦材料中，有9个材料用三个标记均扩增出与目标条带，有4个材料扩增出一或两个标记的目标条带。在三个分子标记检测均为阴性的小麦材料中，2个材料(节燕2000和PIC447)在2015年表现中抗。即用三个分子标记检测为阳性的材料不一定表现抗病，部分表现抗病的材料用本研究所用的三个分子标记检测不到Fhb1基因。导致分子检测与表型鉴定结果不完全一致的主要原因可能为：① 不同小麦材料遗传背景不同，抗病基因与其他基因互作导致其效应改变，携带有某个抗病基因的材料表型不一定表现为抗病[18-19]； ② 小麦赤霉病抗性表现为数量性状遗传，不同小麦品系所含的抗病基因不同[20]。推测本研究中表现抗病而没有检测Fhb1基因的材料可能含有Fhb1以外的抗病基因。

前人研究表明，赤霉病抗性往往与株高等不良的农艺性状连锁。有学者认为，小麦赤霉病抗性与株高呈正相关[21]。 另有学者认为，小穗密度对植株抗赤霉病侵染能力有一定影响，小穗密度越高越易感病[22]。这可能是因为植株较高、小穗密度较小的小麦穗部周围的小环境湿度偏低，抑制了病原菌的侵入[23-24]。Gervais 等[25]检测出 3 个赤霉病抗性主效 QTL 与植株高度 QTL 重叠，表明小麦株高与赤霉病的抗性具有一定的相关性。本研究结果与这些报道相似，如抗病的13个小麦材料，有 7 个株高在 1 m 以上，除材料 15HN042 外，其他抗病材料的小穗密度都较低。

结合农艺性状与表型鉴定的结果，本研究共筛选出三个抗病且农艺性状较好的小麦品(种)系(15HN018、15HN200和宁麦9号)，可以作为小麦抗赤霉病育种的优质种质资源，宁麦9号经三个SSR标记检测均为阳性，可以优先考虑在小麦抗赤霉病育种中应用。其他表型抗病、分子检测为阴性的小麦品(种)系可以作为挖掘其他抗病QTL的种质资源。由于本研究所用的小麦材料较少、来源地偏窄，表性鉴定也仅在一个试验地点进行，为抗赤霉病育种提供的种质资源相对有限，因此，还需继续收集更多的材料、进行更多优异的鉴定以服务于小麦育种和生产。