高效液相色谱法评价海洋生物中半胱亚磺酸脱羧酶活性

张千伟 徐红萍 毛丽沙 金火喜

摘要[目的]建立磺基丙氨酸（CA）的高效液相色谱分析法，并以CA为底物，评价不同海洋生物组织中半胱亚磺酸脱羧酶（CSD）的活性。[方法]以AgilentEclipseXDB-C18为色谱柱，采用邻苯二甲醛（OPA）进行柱前衍生，检测波长为315nm，对衍生化过程及色谱条件进行了优化。[结果]当CA∶OPA（物质的摩尔比）=1∶2、衍生时间2min、流动相甲醇∶乙酸钠=65∶35（V/V）、流速1mL/min时，CA具有最优的检测效果。在该条件下，CA浓度在10～500μg/mL具有良好的线性关系（R2>0.99），平行样品的相对标准偏差为0.9%～8.6%，保留时间为1.4～1.5min。不同海洋生物组织中CSD活性检测结果显示，在所选择的海洋贝类、头足类、鱼类中，贻贝、疣荔枝螺和大黄鱼均未检测到CSD活性;蛏子、血蛤、芝麻螺和鱿鱼中CSD活性较低。不同组织比较，海鲈鱼肝脏中CSD活性最高，达21.8U/mg，而肉和鳃中则未检测到CSD活性。[结论]不同海洋生物体内牛磺酸的合成途径不尽相同。

关键词海洋生物;半胱亚磺酸脱羧酶;磺基丙氨酸;高效液相色谱

中图分类号TS201.2文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）01-0212-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.062

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

牛磺酸，又称β-氨基乙磺酸，是动物体内含硫氨基酸代谢的最终产物之一。牛磺酸广泛分布于哺乳动物和海洋生物中，像哺乳动物的脑、肝脏及贝类、螺类等海洋生物中牛磺酸的含量均十分丰富[1-5]。牛磺酸被认为具有广泛的生理学功能，如保护细胞膜、解毒以及抗氧化等[6-7]。研究证明，牛磺酸还具有促进大脑发育、增强人体免疫和改善视力等功效[8-10]。

牛磺酸的生物合成途径较为复杂[11]，不同的生物体内其合成途径存在一定差异。研究发现，通过半胱氨酸双加氧酶（CDO）催化半胱氨酸形成半胱亚磺酸（CSA），再经半胱亚磺酸脱羧酶（CSD）催化脱羧生成亚牛磺酸，最后氧化成牛磺酸是生物体内合成牛磺酸最主要的途径[12]。除此之外，某些生物还可以通过CSA—磺基丙氨酸（CA）—牛磺酸途徑或半胱胺—亚牛磺酸—牛磺酸途径等旁路途径来合成牛磺酸。例如，蓝鳃太阳鱼（Lepomismacrochirus）中具有较高的半胱胺双加氧酶（CAD）活性[11]，可以通过CA脱羧形成牛磺酸[13]。在上述途径中，CSA和CA的脱羧反应均由同一个酶CSD催化。目前，有关牛磺酸生物合成途径的研究主要集中在主要途径上，对CA脱羧生成牛磺酸途径的研究鲜有文献报道。据此，该研究以CA为底物，对不同海洋生物组织中CSD的活性进行检测和筛选，弥补国内该研究领域的空白，为进一步明确不同海洋生物体内牛磺酸的合成途径提供参考。

从海洋生物组织样品中提取CSD粗蛋白，加入底物CA，在缓冲体系中进行反应，通过分析反应前后CA含量的变化可评价样品中CSD的活性。氨基酸通过异硫氰酸苯酯、单磺酰氯、邻苯二甲醛（OPA）等衍生化后可在高效液相色谱上进行检测[14-16]，其中OPA衍生法因安全、简便、快速的特点而被广泛应用。该试验采用OPA为衍生剂，甲醇-乙酸钠为流动相，拟建立峰形良好、快速灵敏的CA检测方法，利用该方法评价不同海洋生物中CSD的活性。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试材。

贻贝、血蛤、芝麻螺、疣荔枝螺、海鲈鱼等海洋生物购于舟山市乐购超市。

1.1.2药品与试剂。

磺基丙氨酸（CA）、牛磺酸、邻苯二甲醛（OPA）、牛血清蛋白、甲醇、乙酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铵、硼酸、氢氧化钠、巯基乙醇和考马斯亮蓝G-250等药品和试剂均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3仪器与设备。

1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）;FS-1高速匀浆机（江苏金坛市环宇科学仪器厂）;SHZ-88A水浴恒温振荡器（苏州市培英实验设备有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1溶液的配制。

衍生试剂：准确称取0.01gOPA于1mL甲醇中，超声波辅助下溶解，再加入10μL巯基乙醇，用0.4mol/L的硼酸钠缓冲液（pH9.5）定容至10mL即可，现配现用。CA标液（1mg/mL）：准确称取0.05gCA固体，溶解于50mL0.2mol/L磷酸盐缓冲液中（pH7.4）。牛血清蛋白标准液（0.1mg/mL）：准确称取0.01g牛血清蛋白溶解于100mL0.2mol/L磷酸盐缓冲液中。考马斯亮蓝试剂：准确称50mg考马斯G-250，将其溶于50mL95%乙醇中，再加入50mL85%磷酸，定容至500mL。

1.2.2CA高效液相检测。

取CA溶液250μL至离心管中，加入一定量的衍生剂，在37℃水浴下进行衍生化反应。反应液经0.45μm微孔滤膜过滤，立刻进行HPLC分析。色谱条件：色谱柱AgilentXDB-C18（4.6mm×150mm，5μm），流动相甲醇-乙酸钠溶液，波长315nm。根据峰形、峰面积、保留时间等指标对流动相比例、流速、衍生剂用量、衍生化时间等条件进行优化。

1.2.3CA标准曲线绘制。

将CA标准液（1mg/mL）用超纯水依次稀释成0.50、0.40、0.20、0.10、0.05、0.02、0.01mg/mL7个质量浓度梯度。按照“1.2.2”步骤，在最优条件下对CA浓度进行测定。以CA质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.4精密度试验。

分别取0.01、0.10和0.50mg/mL的CA标准溶液，按照“1.2.2”步骤，在最优条件下对CA浓度进行测定。每种质量浓度平行测定3次，记录峰面积，并计算相对标准偏差。

1.2.5样品中CSD活性检测。

将新鲜的海洋生物洗净，取肉、内脏、鳃等组织部分。分别称取20g，加入50mL磷酸盐缓冲液，在循环水控温下，匀浆30min。将匀浆液置于8000r/min下离心20min，去沉淀。上清液在4℃下用70%硫酸铵盐析4h，10000r/min离心15min，弃上清液。沉淀中加入50mL磷酸盐缓冲液，并置于同种缓冲液中透析12h，中途更换一次缓冲液。试验组取透析后的粗酶液1mL，加入0.05mol/L的CA溶液1mL，再加入0.2μmol磷酸吡哆醛和4.0μmol巯基乙醇。另取0.05mol/L的CA溶液1mL，加入1mL磷酸盐缓冲液、0.2μmol磷酸吡哆醛和4.0μmol巯基乙醇，作为空白组。将试验组和空白组均于37℃、120r/min条件下反应2h，反应液按照“1.2.2”方法检测CA的含量。在上述反应条件下，每分钟催化反应掉1nmolCA所需的酶量定义为一个酶活单位（U）。

1.2.6粗酶液的蛋白浓度测定。

采用考马斯亮蓝法测定粗酶液中蛋白质浓度。配制一系列浓度梯度的牛血清标准蛋白液，各取1mL标准液，加5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀后在595nm测吸光度。以牛血清蛋白浓度为横坐标、A595nm为纵坐标，绘制牛血清蛋白标准曲线。取1mL样品粗酶液，加5mL考马斯亮蓝，摇匀后测A595nm，依照牛血清蛋白標准曲线计算样品蛋白浓度。

2结果与分析

2.1流动相比例选择

选用甲醇与0.05mol/L的乙酸钠作为流动相，分别选择体积比20∶80、30∶70、40∶60、50∶50和65∶35进行试验，结果如表1所示。由表1可知，在所选的所有体积比下，CA均能达到很好的分离效果，但保留时间随着甲醇比例的增加而缩短。综合考虑峰面积（较大为宜）及保留时间（较短为宜），确定流动相甲醇-乙酸钠的比例为65∶35。

2.2流动相流速优化

流动相的流速是高效液相色谱检测法的一个重要因素，流速过慢，峰形变宽，保留时间延长，效率降低;流速过快则峰面积太小，导致灵敏度降低。该试验选择甲醇-乙酸钠（65∶35，V/V）为流动相，考察了不同流速（0.6、0.8、1.0、1.2、1.5mL/min）对CA（1mg/mL）检测的影响。从表2可以看出，流速对CA的出峰时间及峰面积均有显著影响，随着流动相流速的不断增大，保留时间逐渐缩短，峰面积则不断下降。综合考虑峰面积和保留时间，选择1.0mL/min为最终流动相的流速。

2.3衍生剂用量选择

该研究采用OPA对CA进行衍生化，OPA的用量对衍生化产物的浓度有直接影响。OPA用量不足，衍生化反应不完全，目标物质峰面积减小;OPA用量过多，则会导致药品的浪费。该试验考察了OPA的不同用量（CA与OPA的摩尔比分别为2∶1、1∶1、1∶2、1∶3和1∶5）对CA检测的影响，结果如表3所示。由表3可知，随着OPA用量的增加，CA峰面积也逐渐增加;当OPA与CA的摩尔比超过2∶1时，峰面积趋于稳定，说明OPA已经过量。所以，最终选择OPA与底物CA的摩尔比为1∶2。

2.4衍生化时间优化

该试验考察了底物CA与衍生试剂OPA反应的时间对峰面积的影响，结果如图1所示。由图1可知，随着反应时间的增加，峰面积从0.5min时的7335迅速增加至2min时的11109，说明CA与OPA反应迅速。然而，随着反应时间的继续延长，峰面积有缓慢下降的趋势，说明衍生化产物不是十分稳定，会慢慢分解。所以，该试验采用衍生时间为2min。

2.5CA色谱图与标准曲线

在上述最优条件下，CA标样（1mg/mL）的色谱图如图2，可见其峰型美观，且没有杂峰干扰。以CA质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制CA标准曲线，如图3所示。当CA在10～500μg/mL时，CA质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为y=12134x+9.519（R2=0.991）。

2.6精密度试验

选择3个不同质量浓度的CA标样，分别为低质量浓度（10μg/mL）、中质量浓度（100μg/mL）和高质量浓度（500μg/mL），同一样品重复测定3次，峰面积见表4。这3种质量浓度的CA标样相对标准偏差分别为8.6%、0.9%和4.9%，说明该方法精密度较高，具有良好的重复性。

2.7海洋生物样品中CSD活性的评价

该试验选择了舟山海域常见的几种海洋生物，将其组织经洗净、匀浆、盐析和透析后得粗酶液。粗酶液中蛋白含量按“1.2.6”中方法进行测定，其牛血清蛋白标准曲线如图4所示。由图4可知，牛血清蛋白标准曲线有良好的线性关系。分别向各组织样品初酶液中加入底物CA，37℃、120r/min条件下维持2h，检测反应前后CA含量的变化，从而评价样品中CSD的活性。

从表5可以看出，在所选择的海洋生物中，贻贝、疣荔枝螺和大黄鱼体内未检测到CSD活性，而蛏子、血蛤、芝麻螺和鱿鱼体内均检测到CSD活性。该结果说明，贻贝、疣荔枝螺和大黄鱼不具有通过CA合成牛磺酸的能力，而蛏子、血蛤、芝麻螺和鱿鱼则可以通过这个途径合成牛磺酸。针对海鲈鱼和美国红鱼不同组织的检测结果发现，不同组织中CSD活性也有明显差异。海鲈鱼肠和肝中CSD活性的活性分别达6.0和21.8U/mg，而肉和鳃中则未检测到CSD活性;美国红鱼肠中检测到很低的CSD活性，其他组织中则未检测到CSD活性。柳小英等[17]报道这些组织中均含有一定量的牛磺酸，结合该试验结果，说明同一种生物的不同组织可以通过不同的途径来合成牛磺酸。

海洋生物尤其是海洋贝类、螺类、鱼类等，其体内牛磺酸的含量十分丰富，是获取天然牛磺酸的宝库。牛磺酸在不同组织中的含量差异较大，一般来说，肝脏中牛磺酸含量较高。CSD是很多生物体内牛磺酸合成的关键限速酶，其活性的大小往往决定了牛磺酸含量的高低。CSD可以介导牛磺酸合成的2条途径，但不同生物组织内的CSD对CSA和CA的活性有所差异。研究发现，蓝鳃太阳鱼肝脏内CSD对CSA的活性远远大于CA，真鲷肝脏内CSD则对CA的活性大于CSA，而来自虹鳟鱼肝脏的CSD对CA基本没有活性[12-13]。所以，该研究以CA为底物，检测海洋生物体内CSD的活性，可一定程度上分析不同海洋生物体内牛磺酸的合成途径，为揭示牛磺酸的合成机制提供一定的参考基础。

3结论

该试验建立了磺基丙氨酸的高效液相色谱分析方法。采用OPA进行衍生，检测波长315nm，流动相甲醇∶乙酸钠=65∶35（V/V），流速为1mL/min，CA∶OPA=1∶2，衍生时间

2min。该方法在10～500μg/mL质量浓度范围内具有良好

的线性关系（R2>0.99），相对标准偏差为0.9%～8.6%。以CA为底物，利用该方法评价不同海洋生物中CSD的活性，结果发现，不同的海洋生物中CSD活性差异较大，其中海鲈鱼肝脏中活性最高，而大黄鱼、贻贝和疣荔枝螺中未检测到CSD活性。该研究表明不同海洋生物体内牛磺酸的合成途径有所差异。

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