三种茶碱缓释片含量测定方法比较

杨国宁 刘延娟 仝桂平 赵蕊蕊 毕天琛

茶碱类药物具有扩张支气管、抗炎、调节免疫、抑制血小板活性[1]等作用，是治疗哮喘的常用药物。为确保血药浓度处于稳定状态，缩减血药浓度波动引起的异常，避免不良反应产生，缓释剂为其常见剂型。

测定茶碱的方法包括容量分析法、紫外分光光度法（UV）[2]、高效液相色谱法（HPLC）[3-4]等。茶碱缓释片因疗效确切、质量易控一直收载于《中华人民共和国药典》[5]中，现行药典[6]采用容量分析 法测定茶碱缓释片的含量。笔者在工作中发现，传统的容量分析方法存在一定不足，本研究就3 种茶碱缓释片含量测定方法的可行性进行分析，现报道如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

XS-105 电子分析天平（梅特勒-托利多）；Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；pHS-3C 型pH 计（上海大普）；恒温水浴振荡器（常州菲普）。

1.2 试剂与试药

茶碱对照品（中国食品药品检定研究院；批号：100121-201104；含量：100.0%）；可可碱对照品（中国食品药品检定研究院；批号：100110-201202；含量：100.0%）；茶碱缓释片4 批（批号：20180703、20180707、20180911、20180919，规格：0.1 g/片）；醋酸钠，醋酸铵，冰醋酸（分析纯）；甲醇、乙腈（色谱纯），超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 方法1色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为醋酸盐缓冲液（取醋酸钠1.36 g，加水100 ml 溶解，加冰醋酸5 ml，再加水稀释至1000 ml）∶乙腈（93∶7）；检测波长：271 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；进样体积：20 μl[6]。

2.1.2 方法2除流动相为醋酸盐缓冲液（取醋酸铵0.771 g，加水800 ml 溶解，用冰醋酸调节pH 值至5.5，再加水稀释至1000 ml）∶甲醇（75∶25）[7]外，其他色谱条件同方法1。

2.2 溶液制备

2.2.1 系统适用性溶液制备精密称取茶碱对照品与可可碱对照品适量，加流动相溶解并稀释制成10 μg/ml溶液。

2.2.2 对照品溶液制备精密称取茶碱对照品适量，加流动相溶解并稀释制成100 μg/ml 溶液。

2.2.3 供试品溶液制备取本品20 片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于无水茶碱0.1 g），置量瓶中，加流动相适量，70℃水浴震荡20 min[5]，加流动相稀释制成100 μg/ml 溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性取2.2.1项下系统适用性溶液20 μl，在2.1.1 和2.1.2 色谱条件下分别进样，按茶碱峰计，理论板数分别为9568、7800。可可碱与茶碱的分离度分别为10.5、8.8。理论塔板数均大于5000，分离度均大于2.0[6]。

2.3.2 精密度分别取对照品溶液20 μl，连续进样6 针，方法1 茶碱平均峰面积为7802.14，相对标准偏差（RSD）为0.12%；方法2 平均峰面积为7749.03，RSD 为0.05%。

图1 系统适用性色谱图

2.3.3 线性关系考察精密称取茶碱对照品适量，加流动相溶解并稀释制成1000 μg/ml 溶液，分别量取上述溶液0.05 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、5.0 ml 置10 ml 量瓶中，加流动相稀释至刻度，分别进样20 μl，以峰面积为纵坐标，进样浓度（μg/ml）为横坐标，绘制标准曲线，结果茶碱分别在5.34～534 μg/ml、5.12～512 μg/ml 范围内线性关系良好，回归方程分别为y=64.074x+3.0107（r= 0.9999）、y=65.799x+55.240（r=0.9997）。

2.3.4 检出限与定量限考察取2.3.3 项下对照品溶液，用流动相逐级稀释，依法测定，S/N≈10 时测得定量限分别为0.13 μg/ml、0.10 μg/ml。S/N≈3 时测得检出限分别为0.045 μg/ml、0.026 μg/ml。

2.3.5 回收率考察精密称取茶碱对照品适量，加流动相溶解成 500 μg/ml 溶液；精密称取样品（20180703）6 份，按2.2.3 项方法稀释成1000 μg/ml溶液；分别精密量取上述对照品溶液2.00 ml 与供试品溶液1.00 ml 置10 ml 量瓶中，加流动相稀释至刻度，按照含量测定方法，计算回收率。见表1。

表1 回收率测定结果(n=6)

2.4 含量测定

采用上述两种方法及《中华人民共和国药典》2015年版二部收载方法，对4 批茶碱缓释片含量进行测定，结果见表2。含量测定结果两两进行配对样品t检验（α=0.05），P值分别为0.067、0.616、0.465，说明3种方法测得结果比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 含量测定结果(%)

3 讨论

3.1 容量分析法与HPLC 法比较

现行药典收载的茶碱缓释片含量测定方法为容量分析法，以茜素磺酸钠指示液为指示剂，加入定量硝酸银滴定液，用氢氧化钠滴定液滴定，计算茶碱含量。指示剂变色趋势为由黄至紫（pH 值3.7～5.2），滴定过程中，难以确定微红色的滴定终点。茶碱与硝酸银反应生成乳白色沉淀，沉淀可干扰颜色变化，判断终点难度较大。HPLC 法可以避免主观因素对终点判断的影响。

3.2 UV 法与HPLC 法比较

茶碱具有良好的紫外吸收，采用UV 法测定茶碱含量的报道屡见不鲜。但茶碱与可可碱在270～275 nm波长处均有较强吸收，传统UV 法无法排除可可碱的干扰。在可可碱和茶碱同时存在情况下，Abuirjeie等[7]采用一阶导数光谱法和二级导数光谱法测定茶碱。

与UV 法的局限与导数光谱法的复杂计算相比较，HPLC 法更准确、简便、快捷。并且，茶碱缓释片中，不仅含有可可碱，还可能有咖啡因、杂质B、C、D[8]等干扰，UV 法无法排除相互干扰，但HPLC法可以对每个杂质准确定量。

茶碱缓释片质量标准中，有关物质项下，必须采用HPLC 法，含量测定中，也采用相同的HPLC法，就可以实现处理一次样品，检验两个项目，提高工作效率。

3.3 两种HPLC 法比较

本文中的方法1 和方法2 的系统适用性试验均能达到要求，在精密度、定量限、检出限、回收率的考察中，方法2 更具优势，且保留时间短，可节省实验时间。

4 结论

本文对两种HPLC 测定茶碱缓释片含量的方法进行了方法学考察，精密度均良好；在一定质量浓度范围内，线性关系良好；回收率试验RSD 值均较小。HPLC 方法简单、结果准确，可作为茶碱缓释片质量控制的有效方法。方法2 方法学考察结果优于方法1，并且保留时间短，可节约实验时间，提高工作效率。