品种和营养水平对猪背最长肌肌糖原和肌纤维类型的影响

李登赴，郎洪权，何 军

(1. 四川农业大学动物营养研究所动物抗病营养教育部重点实验室，四川 成都 611130；2. 贵阳市畜牧站，贵州 贵阳 550081；3. 贵阳市草地站，贵州 贵阳 550081)

【研究意义】肌糖原含量和肌纤维特性是影响猪肉质的重要因素。在众多影响肉质的因素中，肌纤维类型被认为是调控肉质的关键因素[1-2]，肌纤维占肌肉的75 %～90 %，根据肌纤维的收缩特性可将其分为不同的类型，由不同类型的肌纤维组成的肌肉存在较大差异[3]。而肌糖原含量是影响肉质的本质所在[4]，Hamilton等[5]研究表明，猪背最长肌中的糖酵解潜力(GP)和葡萄糖浓度与肉质具有很好的相关性，可通过糖酵解潜力和葡萄糖浓度来预测肉质。【前人研究进展】本研究室在前期的研究发现，高坡猪和 “杜×长×太”三元杂交猪(DLT)的肉质存在显著差异，不同营养水平对肉质的影响不同[6]，但营养水平对高坡猪和DLT的肌纤维类型及肌糖原含量的影响如何尚未见报道。因此，研究调控不同品种和营养水平间肉质差异的内在机制具有较大生产意义。【本研究切入点】本试验选用体型相近的高坡猪与DLT为试验对象，饲喂不同营养标准配制的全价饲粮，研究不同营养水平对高坡猪、DLT背最长肌肌纤维类型和肌糖原含量的影响。【拟解决的关键问题】旨在探讨营养水平对高坡猪和DLT背最长肌肌纤维类型和肌糖原含量的影响，为深入认识肌纤维类型、糖原含量与肉质的关系提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计与动物

试验采用2×2因子设计，主效应分别为品种(高坡猪、DLT)和营养水平[NRC(2012)、中国猪饲养标准(2004)]。选择初始体重为(61.16±4.13) kg的DLT和高坡猪各12头，分为4个处理：DLT中国猪饲养标准(DLT+C)，DLT NRC饲养标准(DLT+N)，高坡猪中国猪饲养标准(高坡猪+C)，高坡猪NRC饲养标准(高坡猪+N)。

1.2 试验饲粮

饲粮为玉米-豆粕型饲粮，参考NRC(2012)及中国猪饲养标准(2004)相应阶段营养需要配制，饲粮组成及营养水平见表1。

1.3 饲养管理

试验在四川农业大学动物营养研究所教学科研试验基地进行。单栏饲养，预试5 d后进入正式试验。每日饲喂3次(08:30，13:30，18:30)，少喂勤添，喂料量以料槽内略有剩余为度。试验猪自由饮水，圈舍内温度保持在18～20 ℃。

1.4 屠宰及组织取样

屠宰分批进行，当试验猪平均体重达90 kg时，选择体重较大的5头猪进行屠宰，分离左侧胴体，迅速在胸腰椎结合处按肌纤维走向切取2.0 cm×1.0 cm×1.0 cm背最长肌肌肉样2份，投入液氮中保存用以制作冰冻切片，分析肌纤维密度、直径；另取一部分液氮速冻，用以分析肌纤维类型。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 背最长肌肌糖原含量 背最长肌肌糖原含量采用南京建成生物工程研究所肌糖原含量测定试剂盒测定，严格按照说明书操作。

1.5.2 背最长肌肌纤维直径和密度 取解冻后修成1.0 cm×0.5 cm×0.3 cm的肌肉块，用冰冻切片机切成厚2～8 μm的切片，快速HE染色后中性树胶封片。

表1 饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) (%)

注：N：NRC(2012)；C：中国猪饲养标准(2004)，下同；1．维生素预混料为每千克饲粮提供：VA 1200000 IU, VD3300000 IU, VE 750 IU, VK3150 mg, VB160mg, VB2480 mg, VB6180 mg, VB120.9 mg, 泛酸750 mg, 叶酸15 mg, 烟酸105 mg, 抗氧化剂15 mg；2．矿物质预混料可为每千克饲粮提供: 铁100 mg, 铜5 mg, 锌80 mg, 锰3 mg, 碘0.14 mg, 硒0.25 mg；3．营养水平为计算值。

Notes: N: National Research Council (2012); C: Chinese Feeding Standard of Swine (2004),The same as below;1.Vitamin premix provides the following per kilogram of diet: VA 1200000 IU, VD3300000 IU, VE 750 IU, VK3150 mg, VB160mg, VB2480 mg, VB6180 mg, VB120.9 mg, pantothenate 750 mg, folic acid 15 mg, niacin 105 mg, antioxidants 15 mg;2.Mineral premix provides the following per kilogram of diet: Fe 100 mg, Cu 5 mg, Zn 80 mg, Mn 3 mg, I 0.14 mg, Se 0.25 mg;3.Calculated values for nutrients.

背最长肌肌纤维直径：将切片置于10×40倍显微镜下，用多媒体彩色病理图像分析仪进行测定。由于肌纤维横截面积常为不规则图形，无法精确测量其直径。因此本试验参考椭圆形长短轴的测量方法求直径，每个样品测量45条肌纤维。

表2 目的基因与内参基因引物序列

背最长肌肌纤维密度：将切片置于10×10倍显微镜下，用多媒体彩色病理图像分析仪进行测定。随机选15个视野，统计肌纤维数，求均值后换算成每平方毫米内的肌纤维数。

1.5.3 背最长肌肌纤维类型 总RNA提取：组织总RNA的提取采用RNAiso Reagent试剂盒(TaKaRa，中国，大连)，将保存于超低温冰箱的背最长肌样品按照试剂盒的说明书提取组织总RNA。待RNA干燥后用DEPC水溶解，检测所提取RNA的浓度和完整性。

引物设计：根据GenBank公布的MyHCI、IIa、IIb、IIx和18S-rRNA的基因序列来设计引物并检测引物的特异性，以18S-rRNA作为内参。引物由Invitrogen公司合成，目的基因和18S-rRNA基因RT-PCR扩增引物参数见表2。

cDNA合成：cDNA的合成采用SYBR Prime ScriptTMRT-PCR试剂盒(TaKaRa，中国，大连)，严格按说明书操作。

标准曲线制作：目的基因和18S-rRNA基因的标准曲线各6个点，每点3个重复。经反转录反应后的cDNA溶液，使用EASY Dilution将cDNA溶液按106、107、108、109、1010和1011浓度梯度稀释后，各取1 μl进行实时荧光定量PCR反应。

实时荧光定量PCR：采用SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，中国，大连)对内参和目的基因进行PCR扩增。反应体系10 μl：包括5 μl SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、上下游引物各1 μl (4 μM)、DEPC水2和1 μl cDNA(10 ng)。反应条件：95 ℃预变性10 s，95 ℃变性5 s, 退火25 s(退火温度见表2)，40个循环。扩增完后进行熔解曲线分析，温度从65～95 ℃，每0.5 ℃读板1次，每次持续0.5 s，连续检测荧光。

1.6 数据统计与分析

MyHCI、IIa、IIb、IIx基因相对表达量用2-△△Ct法计算[7]。试验数据采用Excel 2010进行整理，采用SAS 9.0软件的一般线性模型(GLM)程序对试验数据进行双因素分析，并用Duncan氏法进行多重比较。结果以平均值和标准差表示，当P<0.05时差异显著，当P<0.01时差异极显著。

2 结果与分析

2.1 品种和营养水平对猪背最长肌肌糖原含量的影响

由图1可见，品种和营养水平对猪背最长肌肌糖原含量有极显著影响，在同样营养水平下高坡猪猪背最长肌肌糖原含量均极显著高于DLT(P<0.01)，高营养水平均极显著降低了DLT和高坡猪的背最长肌肌糖原含量(P<0.05)。

2.2 品种和营养水平对猪背最长肌纤维直径和密度的影响

由图2可知，品种对猪背最长肌肌纤维直径和密度均有较大影响，高坡猪的背最长肌肌纤维直径极显著小于DLT(P<0.01)，而密度极显著大于DLT(P<0.01)，营养水平提高了猪背最长肌肌纤维直径和降低了密度，但差异不显著。

数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05).The same as below图1 品种和营养水平对猪背最长肌肌糖原含量的影响Fig.1 Effects of breed and nutrient level on muscle glycogen of LM of pigs

图2 营养水平对猪背最长肌肌纤维直径(A)和密度(B)的影响Fig.2 Effects of breed and nutrient level on fiber diameter (A)and density (B)of LM of pigs

2.3 品种和营养水平对猪背最长肌肌纤维类型的影响

由图3可知，品种和营养水平对猪背最长肌MyHCIIb有较大影响，高坡猪的背最长肌MyHCIIb均低于DLT，在中国猪饲养标准下高坡猪极显著低于DLT(P<0.01)，在NRC饲养标准下不显著(P>0.05)；营养水平均极显著提高了DLT和高坡猪的背最长肌MyHCIIb的相对表达量(P<0.01)。品种和营养水平对MyHCIIx比例有显著的互作效应，营养水平升高显著提高了DLT猪背最长肌MyHCIIx型纤维比例(P<0.05)，而对高坡猪的背最长肌MyHCIIx型纤维比例无显著影响(P>0.05)。此外，品种和营养水平对猪背最长肌 MyHCI和IIa型纤维比例无显著影响(P>0.05)。

3 讨 论

肌糖原含量是影响最终pH的一个重要因素[8]，猪AMPK的γ亚基PRKAG3的点突变，导致了猪肌肉中葡萄糖代谢包括糖原储备的紊乱，进而引起酸肉的发生[8]。但关于高坡猪和DLT背最长肌肌糖原含量与最终pH的相关性尚不明确。李梦云等[9]在100 kg阶段，汉普夏猪骨骼肌中肌糖原含量显著高于长撒猪，pH24 h显著低于长撒猪，而pH45min则差异不显著。Henckel等[10]研究结果也表明，肌糖原含量与最终pH呈负相关性。研究表明，饲喂相同营养水平的饲粮，高坡猪宰后45 min到24 h之间背最长肌pH的降低较DLT缓慢[6]。在本试验中，高坡猪背最长肌肌糖原含量高于DLT，表明高坡猪较高的肌糖原含量在一定程度上延缓了pH的降低。而高营养水平饲粮降低了高坡猪和DLT的背最长肌肌糖原含量，这与潘洪彬等[11]高能量和高蛋白质日粮均可加快乌金猪肝糖原和肌糖原合成的结论相反。造成此差异的主要原因可能是饲养条件和品种的差异。

图3 品种和营养水平对猪背最长肌MyHCI(A)、MyHCIIa(B)、MyHCIIx(C)和MyHCIIb(D)相对表达量的影响Fig.3 Effects of breed and nutrient level on MyHCI (A)，MyHCIIa (B)，MyHCIIx (C) and MyHCIIb (D) relative expression in LM of pigs

肌纤维的直径和密度是影响肉质的重要指标，肌纤维直径越小而密度越大的品种其肌内脂肪沉积越多[12]。本试验结果表明，高坡猪和DLT的背最长肌肌纤维直径和密度存在一定差异：高坡猪的背最长肌肌纤维直径小于DLT，而密度大于DLT。这可能是高坡猪虽然生长速度缓慢，但肉质较好的原因。李登赴等[6]对比了高坡猪和DLT的肉质，结果也表明高坡猪肉质优于DLT。在本试验中，营养水平升高仅显著增加了DLT的背最长肌肌纤维直径，而对高坡猪和DLT肌纤维密度无显著影响。由此推测，影响肌纤维直径和密度的主要因素是品种。但营养与品种间互作效应对肌纤维的影响还有待进一步研究。近年来虽然通过环境条件控制、营养改进及遗传育种等手段调控猪产肉性能有了明显改善且瘦肉率及生长发育速度也得以提高，但也同时降低了猪的肉质，在以后的猪研究中，重点在于如何寻找几者之间的平衡点。

品种对肌纤维类型百分组成的影响，具有中等以上的遗传力(h2=0.2～0.59 )，其中I和IIb型肌纤维比例具有高遗传力，分别为0.46和0.58[13]。本实验中两品种背最长肌MyHCIIb型纤维表达差异极显著，表现为高坡猪IIb型肌纤维极显著低于DLT。高坡猪和DLT的差异是长期不同生长环境影响的结果，猪出生后肌纤维数目不再发生变化肌肉生长速度主要由肌纤维体积决定。此结果与以往国内很多结论一致，杨晓静等[14]通过比较二花脸猪和大白猪背最长肌肌纤维组成差异发现，大白猪90 d后IIb型肌纤维显著高于二花脸猪，IIb型肌纤维比例的显著增加可能与其肌肉快速沉积有关；杨飞云等[15]研究了地方品种荣昌猪与杜×长×大猪背最长肌肌纤维组成差异发现，杜×长×大猪背最长肌含有更多的IIb型肌纤维。同时中国地方品种对比对国外品种也得到类似结果，如金华猪[16]、二花脸猪[15]、梅山猪[17]和莱芜猪[18]等中国地方品种和国外瘦肉型品种的肌纤维类型，发现中国地方品种的背最长肌中氧化型纤维含量较高。

由于猪的肌纤维增殖在出生前就已完成，故出生后的营养状况不会影响肌纤维数，主要影响肌纤维的肥大与类型转化。营养不良可显著降低肌纤维大小，且对快速酵解II型肌纤维的影响程度较其他类型的大[19-20]。本试验结果也表明，营养水平升高显著提高了高坡猪背最长肌MyHCIIb型纤维表达量，而MyHCI、IIa和IIx无显著变化。杨飞云等[21]认为出生后营养还可调控MyHC异构体的表达，进而影响肌纤维类型的转化和肌肉表达。但是营养调控的作用机制还未见相关报道，尤其是营养水平对生长猪肌纤维类型的影响机制。

肌纤维类型是决定肉品质的一个重要因素[22-24]，它与肉品的pH、风味和颜色密切相关。表达不同MyHC异构体的肌纤维具有不同的代谢特性，MyHC I, IIa, IIx和IIb型肌纤维的有氧代谢强度依次递减[25]。经过长期的集约化选育，现代快速生长的猪种在显著提高瘦肉率产量的同时也提高酵解型肌纤维的比例，降低氧化型肌纤维的比例，使肌肉代谢发生变化，从而导致肉品质下降[15]。因此，品种是决定肉质的主要因素之一，不同品种的猪之所以肉品质不同，归根结底是由于肌纤维类型不同，这也是中国地方品种猪肉质优良的原因。

4 结 论

综上所述，品种和营养水平对猪肌糖原含量、肌纤维组织学特性和类型均有不同影响，高坡猪和DLT的背最长肌肌纤维直径、密度和肌纤维类型差异较大，同时营养水平对两品种背最长肌肌糖原含量和MyHCIIb型肌纤维影响也较大。在本试验中，高坡猪的背最长肌肌纤维直径和MyHCIIb型肌纤维均极显著低于DLT，密度也极显著大于DLT，这可能与李登赴等[6]高坡猪优良的肉质相关。今后肌纤维类型的转化及其调控因素，肌纤维类型与肉品质之间的关系等还需要更加深入的研究。