丛枝菌根真菌对还田稻秆分解的影响

贾艳艳，杜小凤，施洪泉，高怀中，孔祥仕，顾大路，杨文飞，诸 俊，王伟中*

(1. 江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所，江苏 淮安 223001；2. 南京大学，江苏 南京 210093)

【研究意义】稻-麦轮作是江苏省粮食生产的主要耕作制度，其稻茬麦面积占小麦播种面积的70 %以上[1]。近年来随着水稻产量水平的不断提高，其副产品秸秆量也随之增大，秸秆就地还田成为秸秆绿色处理、维持农业可持续发展的重要手段[2]。越来越多的秸秆在农田土壤中被分解。作物秸秆的分解过程主要是在土壤微生物及其分泌的各种酶系统作用下将复杂的有机化合物分解为简单的小分子来完成的[3-4]。而土壤的生化过程受控于酶的催化活性，因此土壤微生物的生物活性、群落结构组成及其代谢酶的多样性决定着秸秆在土壤中的分解状态和最终的还田效果。丛枝菌根(Arbuscularmycorrhizal，AM)真菌是土壤微生物区系中分布最广泛的一类真菌，能与80 %的陆生植物形成共生体。这种共生体的互利性是通过双向营养交换来体现的：植物通过光合作用给菌根真菌提供碳水化合物，而菌根真菌通过其强大的外部菌丝系统提高植物对土壤矿质营养元素的吸收，增强植物对外界不良环境的抵抗能力[5]。【前人研究进展】一般认为AM真菌营专性活体共生，不具腐生性。自Hodge等在Science中从报道了AM真菌可加速有机物分解后，AM真菌对凋落物分解的积极作用日益受到重视[6]。Cheng等发现增加二氧化碳浓度后AM真菌能通过促进作物光合产物的释放来调控分解系统，推测AM真菌与分解系统之间存在供求关系[7]。分根装置对AM真菌与凋落物的分解关系研究也证明了接种AM真菌能够通过提高土壤酶活性、增加微生物量的大小和活性作用于玉米秸秆[8-9]和蚕豆秸秆[10]的分解过程，加快秸秆的分解。本课题组最新研究发现，在中等土壤养分环境中，AM真菌通过增大菌丝密度和硝酸还原酶的活性显著促进了栓皮栎凋落叶的分解速率[11]。【本研究切入点】水稻是全球产量最大的粮食作物，还田稻秆的分解对整个农田土壤的养分含量具有主导和支配作用。接种AM真菌是否会影响农田稻秆的分解过程，对深入理解AM真菌在农田土壤养分循环系统中的作用有重要意义。目前为止，稻-麦轮作农田土壤生态系统中AM真菌对还田稻秆分解过程的影响还缺少深入研究。【拟解决的关键问题】本试验以盆栽小麦作为宿主植物研究了接种AM真菌对还田稻秆分解的影响，通过测定分解速率、土壤微生物量和分解酶活性的变化情况，解析AM真菌对稻秆分解的作用及影响机理。研究为AM真菌对还田稻秆的有效分解和元素转化机制提供基本参考依据，对于维持农田生态系统的物质循环和能量流动及提高农田土壤肥力具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土壤：盆栽用土采集自淮安市农科院科研创新基地稻田(119°03′57″E, 33°52′89″N)。土壤类型为沙壤土，肥力中等，pH 7.65。土壤(0～20 cm)有机质含量22.84 g·kg-1，全氮1.26 g·kg-1，速效磷46. 27 mg·kg-1，速效钾85.35 mg·kg-1。采集的土壤风干后过2 mm筛，在121 ℃下湿热灭菌2 h备用。

宿主作物：小麦种子为淮麦30号。播种期为10月底，种子以10 % H2O2表面消毒10 min，用去离子水反复清洗数遍后，沥干水分备用。

供试秸秆：为新鲜收获的南粳9108地上部分稻秆，统一切割长度(10 ± 2 cm小段)，室内60 ℃烘干后备用。

供试菌剂：摩西球囊霉Glomusmosseae、根内球囊霉G.intraradices和幼套球囊霉G.etunicatum。菌种购买自北京市农林科学院植物营养与资源研究所。菌种预先经高粱盆栽繁殖，接种菌剂含有扩繁后产生的相应基质以及AM真菌孢子、根外菌丝和植物根段，每克菌剂含有10～20个孢子。

1.2 试验设计

本试验采用室内盆栽法。所用塑料盆大小为30 cm口径 × 30 cm高，每盆放置4.5 kg灭菌土。试验设置4个处理，以灭菌处理接种为对照，分别为：小麦 +G.mosseae(GM)、小麦 +G.intraradices(GI)、小麦 +G.etunicatum(GE)和小麦 + 灭菌菌剂对照(CK)，每个处理3个重复。土壤施肥量按照高产小麦栽培肥料运筹方案肥量进行施肥，纯氮250 kg·hm-2、纯磷 8 kg·hm-2、纯钾 9 kg·hm-2，基追比例为5∶5(苗肥∶拔节肥∶孕穗肥 = 5∶1.5∶3.5)。

盆栽中稻秆还田量参考已报道的水稻草谷比，模拟以中量级8000 kg·hm-2还田量在盆深15 cm土层处网袋法直接还田。各盆土壤放置稻秆后在盆深10 cm处进行菌剂接种处理。小麦以10粒/盆进行盆栽，出苗后定苗5株。所有盆栽置于作调中心人工气候室中随机排列，生长期间控制土壤含水量保持在60 % ～70 %，室温维持在25～30 ℃，光照时间为10 h·d-1。试验共持续7个月，期间每月取样1次。共设置84个盆栽(4个处理 × 3个重复 × 7次取样)。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 菌根侵染率的测定 将小麦根系洗净，剪成 0.5～1 cm左右长度，放入试管或者其它染色容器内，加入10 %的KOH溶液，于90 ℃水浴锅内脱30～60 min，后再用水将碱液冲洗3次；用浓度为2 %的HCl溶液浸泡3～5 min，洗净。用酸性品红染色溶液染色根段，于90 ℃水浴锅中染色20～30 min。用镊子挑选染色后的根系，整齐摆放于载玻片上，加盖洁净的盖玻片，采用方格交叉法测定小麦根系的菌根侵染率。

1.3.2 秸秆剩余量和土壤胞外酶测定 秸秆剩余量测定：在第7个月最后1次取样后小心去除盆栽秸秆表面的土壤，60 ℃烘干至恒重后称量秸秆剩余量。

土壤微生物呼吸量的测定：采用底物诱导呼吸方法[12]。将1.0 g新鲜土样加入100 mL的西林瓶中，加入1 mL 0.01 g·mL-1的葡萄糖溶液，在通风处敞口放置30 min，测定瓶内CO2浓度(μl·L-1)。封口25 ℃培养1 h后，再测1次CO2浓度，计算出前后2次差值。土壤微生物量单位定义为1 g土样1 h内分解0.01 g葡萄糖所产生的CO2量。

室内实验在江苏徐淮地区淮阴农科所中心实验室进行，所用溶液和化学试剂均为国药分析纯。

1.4 数据分析

7个月后的分解率根据Olson[19]的方法计算，计算公式为：

k= -ln(xt/x0)/t

式中，k为稻秆分解率(月-1)，x0为稻秆的初始质量，xt为“t”个月(本文中t= 7)后凋落物的剩余量。

试验数据采用SPASS 19.0软件进行统计分析，5 %水平下Tukey HSD检验各处理平均值之间的差异显著性。所有的图片在Origin 2016软件中制作完成。

2 结果与分析

2.1 接种菌剂的侵染率

菌根侵染率是菌株在土壤中与宿主共生生长状况的重要指示参数。由图1可以看出，3种菌根真菌接种小麦后在前3个月快速生长，侵染率不断增加，在第4个月达到高峰，并一直持续到第7个月。

图1 接种丛枝菌根真菌后小麦根系侵染率变化(SD,n=3)Fig.1 Changes in the infection rate of wheat roots after being inoculated withArbuscular mycorrhizalfungi

其中侵染共生效果最好的是接种摩西球囊霉菌的GM处理，在第4个月达到92.17 %，其次是GI，第4个月的侵染率达90.31 %。GE处理幼套球囊霉菌的侵染效率最低，在第5个月达到84.21 %的侵染率。因此在当地土壤环境中摩西球囊霉菌和根内球囊霉菌较适合与淮麦30小麦形成菌根共生体。

2.2 接种AM真菌对还田稻秆分解率的影响

分解系数是衡量分解速率的一个指标，分解系数越大其分解速度就越快。由表1可以看出，经过7个月的盆栽分解实验，接种AM真菌的各处理水稻秸秆的分解系数均高于对照处理，其中GM和GI接种处理对稻秆分解速率的促进效果表现显著，增幅分别为26.51 %和16.27 %(P< 0.05)。GE处理下的稻秆分解系数为0.172，虽然高于对照0.166，但无显著差异。该结果表明接种丛枝菌根真菌能加快水稻秸秆的分解速度，提高稻秆中元素的矿化速率。

2.3 接种AM真菌对土壤微生物呼吸量的影响

土壤呼吸是评价土壤基质中碳稳定性的重要指标。土壤呼吸的强度反映了土壤中微生物活性以及对有机质残体分解的速度。土壤呼吸数值越大，土壤微生物量越大，活性也越强。图2数据显示，接菌处理在前2个月对土壤呼吸值的影响较小，无显著差异变化；从第3个月开始各接菌处理下土壤呼吸值均显著增加(第5个月的GM、GE处理和第6个月的GI、GE处理除外)，说明随着菌根真菌的成功定殖，AM真菌促进了土壤微生物的生物量的增加。在同一取样时间下，GM处理的盆栽土壤呼吸值均高于其他处理(第5个月除外)，GI的次之，各处理土壤呼吸量总体趋势为GM>GE>GI>CK，可见接种摩西球囊霉菌对土壤微生物活性的促进作用要优于幼套球囊霉菌和根内球囊霉菌。

表1 接菌处理7个月后秸秆的分解系数(k，月-1)

注：同行不同小写字母表示不同处理间差异显著(P< 0.05，SD,n= 3)。

Note: Different lowercase letters on the same line indicate significant differences among different treatments (P< 0.05，SD,n= 3).

图2 接种丛枝菌根真菌后稻秆周围土壤微生物呼吸量变化(SD,n= 3)Fig.2 Changes in soil substrate-induced respiration of rice straw after inoculated withArbuscular mycorrhizalfungi

2.4 接种AM真菌对土壤胞外酶活性的影响

土壤胞外酶直接参与了土壤营养元素的有效化过程，是土壤中有机质分解的主要介质，其活性在一定程度上反映了微生物的代谢速率和土壤养分转化的动态进程。经过7个月的分解实验，与对照相比，各接菌处理下与碳素分解相关的纤维素酶、与氮素分解相关的蛋白酶和硝酸还原酶以及与磷素转化相关的酸性磷酸酶和碱性磷酸酶均表现出上升趋势。

纤维二糖水解酶和脲酶变化不显著(图3a, b)。

蛋白酶是氮素水解酶类的一种，参与将土壤有机质中的蛋白质、肽类分解为氨基酸，为植物提供氮源。如图3a所示，蛋白酶活性总体表现为接菌处理大于对照处理，GM处理下活性最强(1.64 IU)，显著高于对照9.3 %。说明接种摩西球囊霉菌能促进蛋白酶的分泌，进而可能加快稻秆中含氮有机化合物的水解。

硝酸还原酶是氮素代谢中的关键酶之一，它的活性高低直接影响到植物对土壤中硝态氮素的利用，进而影响作物的产量和品质。图3b显示，GM和GE接种处理后的土壤硝酸还原酶活性均显著高于对照和GI处理(P< 0.05)。因此可能摩西球囊霉菌和幼套球囊霉在对稻秆氮素分解过程中的硝态氮素的矿化方面比根内球囊霉更有优势。

磷酸酶主要在有机磷向无机磷矿化的过程中发挥重要作用。由图3b可知，GM处理显著提高了土壤酸性磷酸酶的活性(10.55 %)。与对照相比，GM和GI两种处理下碱性磷酸酶的活性分别增加了18.35 %和14.93 %。GM处理下酸性和碱性磷酸酶的活性均有所下降。此外碱性磷酸酶与酸性磷酸酶的比值(ALP/ACP)是反应微生物分解功能群类型的敏感指示剂[20]。GM和GI接菌处理显著提高了土壤ALP/ACP比值，这表明稻秆分解土壤微生物对摩西球囊霉菌和根内球囊霉菌株的协作调控反应较敏感，微生物功能群变化较大。

2.5 土壤酶活性和微生物量间的相关性

从表2可以看出，除酸性磷酸酶外，土壤微生物呼吸量和各种酶活之间均有显著相关关系。各种土壤酶活性之间，纤维素酶与纤维二糖糖水解酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶，脲酶与纤维二糖水解酶、硝酸还原酶、蛋白酶、酸性磷酸酶以及碱性磷酸酶与硝酸还原酶、蛋白酶之间均显著相关性；而且碱性磷酸酶与土壤微生物呼吸、蛋白酶与硝酸还原酶之间的相关性极显著(表2)。

CMC表示纤维素酶；PNC表示纤维二糖水解酶；PR表示蛋白酶；UR表示脲酶；NR表示硝酸还原酶；ACP表示酸性磷酸酶；ALP表示碱性磷酸酶；ALP/ACP表示碱性磷酸酶与酸性磷酸酶比值 Abbreviations: CMC, cellulase; PNC, cellobiohydrolase; PR, protease; UR, urease; NR, nitrate reductase; ACP, acid phosphatase; ALP, alkaline phosphatase; ALP/ACP, ratio of alkaline phosphatase to acid phosphatase图3 接种丛枝菌根真菌后稻秆周围土壤酶活性变化(SD,n= 3，数值为7个月的平均值)Fig.3 Changes in soil enzyme activities of rice straw after being inoculated withArbuscular mycorrhizalfungi

表2 土壤微生物量和土壤酶活性间的相关关系

注：*和**分别表示在0.05和0.01水平上差异显著。

Note: * and ** show significant differences at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

3 讨 论

本试验采用网袋法研究了接种3种AM真菌G.mosseae、根内球囊霉G.intraradices和幼套球囊霉G.etunicatum对水稻秸秆分解的影响。在同一宿主植物小麦的前提下，通过测定稻秆分解速率、土壤酶活性和微生物呼吸量的动态变化，明确了AM真菌对水稻秸秆分解的作用。研究结果接种摩西球囊霉菌和根内球囊霉菌能够显著促进稻秆的分解。虽然幼套球囊霉菌的促进作用不显著，但并未抑制稻秆的分解。已有的研究也发现AM菌侵染宿主形成共生体后，会引起植物残体降解速率发生变化[21-22]。在本研究为期7个月的试验过程中，接种摩西球囊霉菌的降解速率均高于根内球囊霉菌和幼套球囊霉菌接种处理，在一定程度上说明摩西球囊霉菌在促进水稻秸秆降解过程中的作用更显著。

理论上认为，AM真菌能够影响植物根际土壤微生物区系及土壤养分含量，从而影响凋落物的分解。Nuccio等的研究报道，AM真菌主要通过氮输出对土壤微生物群落结构进行调控，约10 %的细菌群落、放线菌群落对AM真菌做出积极响应[23]。但也有数据显示在凋落物分解后期(180 d)，AM真菌与土壤微生物群落相互竞争养分，抑制土壤中真菌和细菌类群的生长[22]。Jannoura等研究发现当对土壤微生物的氮素供应不足时，豌豆菌根真菌对玉米秸秆的分解作用显著降低[24]。课题组的最新研究也表明AM真菌对凋落物分解的促进作用与所在土壤的养分含量有关，在中等营养土壤环境中接种丛枝菌根真菌能够调动凋落物中氮素的矿化，加快分解[11]。本研究中接种AM真菌处理的土壤微生物呼吸量普遍显著增加，可能盆栽小麦的适时追肥保证了土壤中足够的养分供给，使得AM真菌与土壤微生物分解功能群之间协调生长，减少了AM真菌与分解微生物对土壤养分的竞争。

土壤酶是土壤系统生化反应大小和方向的调控者，参与土壤中有机物质的分解和转化，影响土壤中的各种代谢过程[25]。土壤酶主要来自土壤微生物的代谢，还有部分来自动植物分泌[26-27]。由于AM真菌不能像腐生微生物群一样直接分泌胞外酶，菌丝单独存在时并不能矿化土壤中的凋落物[28]；但AM真菌能够促进土壤中多种酶类的分泌，增强多种土壤酶的活性，如β-葡萄糖苷酶[29]、碱性磷酸酶[30-31]、过氧化氢酶[9]、脲酶[31]和硝酸还原酶[11]，可能对植物残体的降解产生作用[32]。本研究中接种AM真菌显著促进了与碳、氮和磷分解相关的纤维素酶、蛋白酶、硝酸还原酶、酸性磷酸酶以及碱性磷酸酶的活性，故而本研究中AM真菌促进稻秆分解，除了对分解微生物群的调控作用，还可能通过增加参与稻秆分解过程中的各种土壤的酶活性来促进有机质的分解。研究中各种酶活性的显著提高对解释接种AM真菌提高稻秆的分解速率也提供了依据。

综上分析，本研究发现AM真菌可能通过提高土壤分解微生物群系的生物量，以及提高蛋白酶、硝酸还原酶和磷酸酶的活性，直接或间接的参与催化水稻秸秆的矿化过程，促进稻秆的分解。而且接种摩西球囊霉菌对加快稻秆分解速率、提高土壤酶活性明显优于另外两种菌根真菌。因此，在下一步将AM真菌应用于稻田实践的试验中，摩西球囊霉菌可作为有效筛选菌种之一，以促进稻田有机质的养分循环，获得更高的应用价值。