肉桂丙酮提取物成分分析及其对5种植物病原菌的抑制作用

陆 宽，王巧荣，霍 昕*，高玉琼，冯发进

(1.贵州省生物技术研究开发基地，贵州 贵阳 550002；2.贵州省科晖制药厂，贵州 贵阳 550011)

【研究意义】农产品在种植、采收以及贮藏过程中，因感染病原菌而导致的巨大损失已成为全球性问题。目前，在农产品种植阶段，主要采用化学方法控制植物病原菌的感染及扩散。而在果蔬采后保鲜阶段，控制果蔬采后病害的主要手段是冷藏结合化学抑菌剂。但化学抑菌剂对人类健康和环境的危害已成为全世界关心的问题[1]。因此，开发天然抑菌剂已成为当前农产品保鲜研究的一个热点。【前人研究进展】从中草药中提取的精油具有良好的抑菌能力，具有较高食用安全性，被认为是开发天然抑菌剂的重要原料[2]。肉桂是樟科属植物肉桂的干燥树皮，其性味辛、甘、大热，归肾、脾、心、肝经，具有补火助阳、引火归源、散寒止痛和活血通经的功效。由于其既能作为药材使用，又能作为食物香料，是重要的药食同源作物。肉桂具有较强的抑菌作用，有研究表明，肉桂精油对一些植物病原真菌及果蔬采收后的病原菌具有一定的抑制效果[3-4]。【本研究切入点】但关于肉桂精油对烟草赤星病菌、茄链格孢菌、多隔镰刀菌、灰葡萄孢菌以及大豆炭疽病菌5种植物病原菌的抑菌效果研究较少，并且对肉桂丙酮提取物中物质成分的分析也不够深入。【拟解决的关键问题】以肉桂丙酮提取物为研究对象，通过GC-MS技术对肉桂丙酮提取物的物质组成进行分析，并研究其对5种植物病原菌的作用效果，以期对肉桂丙酮提取物的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

肉桂：购于贵州省中药材公司，经贵州中医药大学陈德媛研究员鉴定为樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干皮及树皮；供试菌株： ACCC 38709烟草赤星病菌(Altternariaaltternata)；ACCC 36023茄链格孢菌(Alternariasolani)；ACCC 36971多隔镰刀菌(Fusariumdecemcellulare)；ACCC 30387灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)；ACCC 36201大豆炭疽病菌 (Colletotrichumglycines)。菌株由贵州大学农学院及贵州省农业科学院植物保护研究所提供。培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。所用试剂均为国产分析纯。

仪器设备：HP-6890/HP5973 GC-MS气质联用(美国惠普公司)，立式自动电热压力蒸汽灭菌LDZX-40BI(上海申安医疗器械厂)；DG-411 型电热恒温培养箱(成都电烘箱厂)；万分之一电子天平(梅特勒托利多仪上海有限公司)；岛津LC-10AT型高效液相色谱议(日本岛津)；RXZ智能型人工气候箱(宁波江南仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 肉桂丙酮提取物GC-MS分析 样品处理：称取一定量的肉桂粗粉，按1∶10比例采用丙酮室温密封浸提，每隔1 h进行震摇，6 h后放置72 h，滤过，收集滤液，即得。

GC条件：弹性石英毛细管柱(HP-5MS 5 % Phenyl Methyl Siloxane )(30 m×250 μm×0.25 μm)；采用程序升温：柱温50 ℃，保持2 min，然后以4 ℃/min程序升温至230 ℃，保持20 min；气化室温度为250 ℃，载气为高纯度氦气(99.999 %)，载气流量2.0 mL/min，柱前压103.977 kPa ，分流进样为1 μl，分流比为40∶1。

MS条件：采用EI源作离子源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，接口温度280 ℃，电子能量70 eV，发射电流 34.6 μA，倍增器电压1936 V，质量范围10～550 amu。

成分分析：通过检索HP MSD化学工作站的两个标准质谱图库，即Nist98和WILEY275两个质谱图库，同时结合有关挥发性物质的文献谱图解析，从而确认所测样品挥发油物质的化学成分。通过HP MSD的化学工作站数据处理系统，按峰面积归一化法进行计算，并求出各化学成分的峰面积的相对百分含量。

1.2.2 5种植物病原菌半最大效应浓度(EC50)测定 各取1 mL按梯度稀释好的肉桂丙酮提取物(肉桂丙酮提取物表1)，分别加入预先灭菌且冷却至约50 ℃的50 mL PDA培养基中，摇匀。将各组含肉桂丙酮提取物的培养基15 mL倒入培养皿内，即为所需含药平板。空白对照组操作同上，仅将肉桂丙酮提取物用等量的丙酮替代。将预培养的5种植物病原菌用直径5 mm的打孔器自菌落边缘切取新鲜菌饼，将菌饼分别接种于各组不同浓度的含药平板中央，盖上培养皿盖，置于培养箱内于28 ℃培养，待空白组菌落直径长满2/3平板后，采用十字交叉法量取各组菌落直径，计算不同浓度肉桂丙酮提取物对5种植物病原菌菌丝的抑制百分率。每组设3个平行。以各处理组肉桂丙酮提取物对数浓度为x轴、菌丝生长抑制率的生物统计几率值为y轴进行回归分析，计算各供试菌的EC50。

菌落直径(mm)=测量值-菌饼直径

菌丝的抑制百分率(%)=

表1 肉桂丙酮提取物浓度梯度

2 结果与分析

2.1 肉桂丙酮提取物中的主要化合物

经GC-MS分离和鉴定，检索图库和相关资料数据，肉桂丙酮提取物共检出10个峰(图1)，鉴定出6种化合物(表2)其中，醛类物质含量最高，为89.6 %；酮类物质其次，为8.33 %；酸类物质和稀类物质含量占比较小，分别为1.16 %和0.91 %。

2.2 肉桂丙酮提取物对5种植物病原菌的抑制作用

2.2.1 对茄链格孢菌和烟草赤星病菌的抑制作用 从表3看出，随着肉桂丙酮提取物浓度的升高，对茄链格孢菌和烟草赤星病菌的抑制作用均呈逐渐增强趋势。当提取物浓度为58.82 mg/L时，对链格孢菌和烟草赤星病菌的抑制率分别为69.80 %和57.28 %，当提取物浓度上升到98.04 mg/L时，抑制率分别为99.08 %和83.5 %。与茄链格孢菌比较，肉桂丙酮提取物对烟草赤星病菌的作用相对较弱，提取物浓度为58.82 mg/L时，对烟草赤星病菌的抑制率较茄链格孢菌的低12.52 百分点；提取物浓度为98.04 mg/L时，对烟草赤星病菌的抑菌率较茄链格孢菌低15.58百分点，说明肉桂丙酮提取物对茄链格孢菌的抑制作用更为敏感。

2.2.2 对多隔镰刀菌、灰葡萄孢菌和大豆炭疽病菌的抑制作用 从表4可知，随着肉桂丙酮提取物浓度的上升，其对多隔镰刀菌、灰葡萄孢菌和大豆炭疽病菌的抑制作用均逐渐增强。肉桂丙酮提取物浓度超过120.67 mg/L时，对多隔镰刀菌的抑菌率均大于50 %；当提取物浓度为201.12 mg/L时，抑菌率为88.39 %。肉桂丙酮提取物对灰葡萄孢菌的抑制作用与多隔镰刀菌相比，以120.67 mg/L提取物浓度为分界点，当提取物浓度>120.67 mg/L时，对灰葡萄孢菌的抑菌率均高于多隔镰刀菌；而≤120.67 mg/L时，对灰葡萄孢菌的抑菌率均低于多隔镰刀菌。说明，当肉桂丙酮提取物浓度较低时，其对灰葡萄孢菌的敏感性低于多隔镰刀菌，而超过一定浓度后，其对灰葡萄孢菌的抑制作用明显升高。肉桂丙酮提取物对大豆炭疽病菌的抑制作用与浓度亦呈现正相关性。与灰葡萄孢菌的抑菌效果相比，提取物对大豆炭疽病菌的抑菌效果均低于灰葡萄孢菌。当提取物浓度为120.67 mg/L时，大豆炭疽病菌的抑菌率较灰葡萄孢菌低3.34百分点，当提取物浓度为201.12 mg/L时，其抑菌率较灰葡萄孢菌低4.24百分点；与多隔镰刀菌相比，提取物浓度为160.89 mg/L时其抑菌率低0.72百分点，提取物浓度达到201.12 mg/L时，抑菌率高出多隔镰刀菌5.91百分点。说明，大豆炭疽病菌比多隔镰刀菌对高浓度肉桂丙酮提取物更加敏感。

图1 肉桂丙酮提取物挥发性成分总离子流图谱Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components of acetone extract fromC.cassia

表2 肉桂丙酮提取物的主要挥发性成分及相对含量

表3 肉桂丙酮提取物对茄链格孢菌和烟草赤星病菌的抑制效果

表4 肉桂丙酮提取物对多隔镰刀菌、灰葡萄孢菌和大豆炭疽病菌的抑制效果

表5 肉桂丙酮提取物对5种植物病原菌的毒力回归方程及EC50值

2.2.3 毒力回归方程及EC50从表5看出，肉桂丙酮提取物对5种植物病原菌的抑制作用均与提取物浓度呈正相关，肉桂丙酮提取物对茄链格孢菌的毒力最大，EC50为45.68 mg/L，对大豆炭疽病菌的毒力最小，EC50为105.09 mg/L。根据毒力回归方程，提取物对茄链格孢菌最敏感，其后依次为灰葡萄孢菌、大豆炭疽病菌以及多隔镰刀菌，对烟草赤星病菌的敏感程度最差。

3 讨 论

目前，关于植物精油对病原真菌的作用机制，主要是通过破坏病菌细胞或菌丝体结构[5]，或破坏细胞代谢系统[6]，抑制菌体及孢子的产生和萌发[7]，从而阻断病原菌后代产生而达到抑菌效果。有研究表明，植物精油的抗菌活性与其化学成分关系密切，其抑菌效果受主成分的化学结构影响很大。通过GC-MS对肉桂丙酮提取物成分进行分析，发现提取物中肉桂醛含量最高。肉桂醛属醛类有机化合物，其广谱抗菌作用已被大量学者佐证，并且有研究表明，醛类中电子容纳能力的强弱以及饱和程度与其抗菌效果的影响有相关性，具有与病原菌生物膜脂成分中分子结构相似成分的植物精油，其抑菌作用较强[8]。

研究结果表明，肉桂丙酮提取物对茄链格孢菌、烟草赤星病菌等5种植物病原菌均有较好的抑制效果。但因各类真菌所属不同类别，因此提取物对其抗菌效果存在一定差异。其中，对茄链格孢菌抑菌效果最好，敏感性最强，其可能是因为肉桂丙酮提取物中肉桂醛的分子结构具有与茄链格孢菌生物膜相似的分子结构，使得肉桂醛透过细胞壁、细胞膜、细胞质膜，从而进入到细胞内部[9]，破坏膜的渗透性[10]，导致细胞内容物外泄而使细胞死亡[11]。

我国物产丰饶，植物资源丰富，具有开发天然防腐保鲜剂的潜在优势。研究结果还表明，肉桂提取物不仅对植物生长期间可能感染的病原菌有抑制作用，对贮藏期可能感染的病原菌同样具有抑制作用。肉桂提取物从农产品的种植到贮藏阶段均能表现出较好的抑菌防腐效果，因此，可为研究学者提供一定参考依据，为拓宽肉桂应用范围提供借鉴，具有良好的开发前景。

4 结 论

在肉桂丙酮提取物中共分离鉴定出4-甲基-4-羟基-2-戊酮、肉桂醛、α-衣兰油烯、香豆素、邻甲氧基肉桂醛和棕榈酸6种化合物。肉桂丙酮提取物对茄链格孢菌、烟草赤星病菌、多隔镰刀菌、灰葡萄孢菌以及大豆炭疽病菌5种植物病原菌均有较好的抑制效果。