血清miR-133、CTGF水平与糖尿病肾病分期和中医证候的关系研究

陆聆韵 袁 民

(上海交通大学医学院附属瑞金医院北院中医科 上海 201801)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最常见的微血管系统并发症之一[1]，目前对于DN各个分期阶段中医证候的分布特点研究甚少。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是近年来新发现的一种细胞因子，与肾小球硬化和肾小管间质纤维化密切相关[2]。除此以外，miR-133b是CTGF的上游调控基因，可抑制肾小管上皮细胞间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[3]，但是是否与DN患者中医证候和分期相关尚缺乏足够的证据支持。因此，本文通过观察不同分期、不同中医证候DN患者血清miR-133和CTGF表达的差异性，为中医辨证治疗提供新的参考思路。

1 临床资料

1.1 病例来源

本项研究选取2016年9月～2018年1月在我院确诊为2型糖尿病患者282例，男性119例，女性163例，年龄18～82岁，平均年龄(60.37±12.82)岁。入选标准：(1)具有确切的2型糖尿病病史；(2)年龄≥18岁。排除标准：(1)肾功能迅速恶化，短期内出现大量蛋白尿或合并肾病综合征；(2)顽固性高血压；(3)合并原发性肾小球疾病或明显异常管型，肾小管功能异常者；(4)合并严重感染、电解质紊乱、糖尿病酮症酸中毒者。该研究方案经我院伦理委员会批准，且与所有患者签署了知情同意书。

1.2 诊断和分期标准

1.2.1DN患者诊断及分期标准[4]

根据丹麦Mogensen分期标准：(1)I期即为肾单位滤过增高期，肾小球滤过率增加，肾脏体积增大，尿白蛋白呈阴性，无明显组织病理学改变，肾小球毛细血管灌注压升高；(2)Ⅱ期即为正常白蛋白尿期，无异常尿白蛋白，肾小球基底膜增厚，系膜基质增生，肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)异常升高；(3)Ⅲ期即为早期DN期，尿蛋白排泄率(urinary albumin excretion，UAE)为20～200μg/min，24h尿白蛋白维持在30～300mg；出现肾小球结节或弥漫性病变以及肾小球动脉玻璃样病变；(4)Ⅳ期即为临床DN期，UAE>200μg/min，或者24h尿蛋白定量>300mg；出现持续性蛋白尿，高血压，并伴有水肿。

1.2.2中医证候诊断标准

参考《消渴病中医临床路径》[5]和《糖尿病肾病诊辩证分型及疗效评定标准(2007试行方案)》[6]，由我科室资深中医师对DN患者进行四诊，并依据临床症状和舌苔脉象对DN患者进行中医辨证分型，根据主证可分为气阴两虚型、脾肾气虚型、气阳两虚型、阴阳两虚型，兼证分为痰浊、湿热、气滞、淤血、热结、郁热、水湿七型。

1.3 研究方法

1.3.1CTGF检测：采集患者入院时的外周静脉血3mL，采用ELISA试剂盒(美国R&D公司)检测CTGF水平。

1.3.2实时定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)法：采用TRIzol试剂盒(日本Takara公司)提取总RNA。根据Taqman®MicroRNA reverse transcription kit和Taqman®MicroRNA assay kit试剂盒(日本Takara公司)说明书进行逆转录反应。按照三步法进行PCR扩增，将20μL反应体系置于37℃恒温水浴60min，85℃5s，加入去离子水至100μL，各反应孔取2μL进行PCR。冰浴中配制20μL PCR反应体系，95℃30s预变性，95℃5s，60℃30s，循环45次。miR-133(F：5'-CTTGGCATTGAGTGAAAGAAC-3'；R：5'-ACAGGAGATAGGCTGGTTTGA-3')；内参U6(F：5'-CATTGGGAGTTTCAAATCAGC-3'；R：5'-CTTTGCATTCTTGGACGAGG-3')。根据使用说明调整基线，将阈值设定在荧光值对数图的线性部分，从软件中读取Ct值。ΔCt=样品Ct均值-内参Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-(随机阴性对照样品Ct均值-内参Ct均值)，以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相对表达量。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 血清miR-133、CTGF与DN不同分期的关系

共纳入282例2型糖尿病患者，包括124例单纯糖尿病患者，即Mogensen分期I期和Ⅱ期患者；86例早期DN患者，即Mogensen分期Ⅲ期患者；72例临床期DN患者，即Mogensen分期Ⅳ期患者。单纯糖尿病患者、早期DN患者、临床期DN患者血清miR-133和CTGF水平存在统计学差异(P<0.05)，且随着病情进展，血清miR-133表达量逐渐降低，而CTGF表达量逐渐升高，见表1。

表1 不同分期DN患者血清miR-133和CTGF水平的差异性

指标单纯糖尿病(n=124)早期DN(n=86)临床期DN(n=72)FP值miR-1331.70±0.351.04±0.31a0.72±0.28ab237.9150.000CTGF(pg/mL)0.18±0.140.57±0.20a0.69±0.21ab223.1310.000

注：a与单纯糖尿病组患者相比，P<0.05；b与早期DN组患者相比，P<0.05。

2.2 血清miR-133、CTGF与DN不同中医证型的关系

不同证型患者miR-133和CTGF水平均存在统计学差异(P<0.05)。其中脾肾气虚型患者血清miR-133水平最高，阴阳两虚型患者血清miR-133水平最低，与其他患者相比，存在统计学差异(P<0.05)，而气阴两虚型患者和气阳两虚型患者血清miR-133水平基本一致，无统计学差异(P>0.05)。另外，脾肾气虚型患者血清CTGF水平最低，阴阳两虚型患者血清CTGF水平最高，与其他患者相比，存在统计学差异(P<0.05)，而气阴两虚型患者和气阳两虚型患者血清CTGF水平基本一致，无统计学差异(P>0.05)，见表2。

表2 不同中医证型DN患者血清miR-133和CTGF水平的差异性

指标气阴两虚(n=116)脾肾气虚(n=89)气阳两虚(n=45)阴阳两虚(n=32)FP值miR-1331.17±0.451.42±0.41a1.16±0.37b1.05±0.39abc9.2710.000CTGF(pg/mL)0.58±0.150.27±0.16a0.54±0.19b0.72±0.17abc102.2090.000

注：a与气阴两虚型患者相比，P<0.05；b与脾肾气虚型患者相比，P<0.05；c与气阳两虚型患者相比，P<0.05。

3 讨论

糖尿病肾病是晚期糖尿病患者主要微血管病变之一，死亡率较高，目前临床上对于DN患者的分期标准一直是沿用丹麦Mogensen分期。近几年，随着中医学理论的深入研究，DN逐渐成为中医治疗领域的重要疾病之一。多项研究证实，通过中医辨证施治，可显著改善DN患者蛋白尿，甚至可逆转肾损伤[7]。目前中医对于DN的治疗仍然存在一定的弊端，如证候判断缺乏客观化指标，过分倚重主观经验评估靶器官损伤的严重程度和病情进展的复杂程度，从而影响辨证论治的客观化和可重复性。因此，从现代药理学角度分析DN的发病机制，选择敏感的监测指标，不仅有利于DN的诊断和分期，而且也可以结合中医证候对患者进行辨证论治。CTGF是近年来关注度较高的肾损伤标志分子之一，在正常生理状态下，血清中CTGF的含量极微，但是在受损的肾脏中表达量迅速升高[8]。另外，有研究显示，miR-133可减缓心肌纤维化，通过作用于CTGF靶点抑制膀胱平滑肌上皮细胞发生间质化转化，同时也是抑制肾小管上皮细胞间质化转化的重要机制[9]。在本项研究中，我们首先证实miR-133和CTGF与DN分期密切相关，随着病情的进展，血清miR-133表达量逐渐降低，而CTGF表达量逐渐升高。

DN发病机制复杂，辨证也变化多端，从本虚证和证实候分析，以组合形式为最常见，可出现气阴两虚证、脾肾气虚证、气阳两虚证、阴阳两虚证；标实候也多见痰浊、湿热、气滞、淤血、热结、郁热、水湿七型。在糖尿病肾病早中期阶段，多以肾气不足为主，血瘀、热结贯穿始终；而在中晚期阶段，肾元虚衰愈甚，湿浊邪毒内生，多见气虚血亏，本虚证可兼阴虚、阳虚，或阴阳两虚证。因此，随着病情进展，本虚证也是经由“阴虚证-气阴两虚证-气阳两虚证-气血两虚证”而发展[10]。另外，在本项研究中，我们发现血清miR-133、CTGF在不同中医证候患者中的表达水平存在明显的差异性。其中脾肾气虚型患者血清miR-133水平最高，CTGF水平最低，阴阳两虚型患者血清miR-133水平最低，CTGF水平最高，而气阴两虚型患者和气阳两虚型患者血清miR-133和CTGF水平基本一致。miR-133和CTGF主要由肾足细胞分泌，miR-133表达量降低，CTGF分泌量升高，提示阴阳两虚证患者肾小球足细胞损伤最为严重，其次为气阴两虚证和气阳两虚证患者。

综上所述，我们发现血清miR-133和CTGF与DN分期和中医证候存在一定的相关性，可作为中西医结合治疗DN的连接点，从而为中医辨证论治提供了客观化参考指标。