艾叶醇提物对热敏通道TRPV1的影响❋

郭 蓉，刘珍洪，汪文来，高 蔚，陶旭光，佟海英，安致君，殷 茵，韩雪珍，Michael XiZhu，杨 桢△，赵红霞△

(1. 北京中医药大学，北京 100029； 2. 中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700；3. 美国德克萨斯大学健康科学中心综合生物学及药理学系，休斯顿)

艾叶具有浓厚的芳香气味，其性味是辛、苦、温，具有温经止血、散寒止痛、止漏安胎的作用，治疗月经不调、痛经、胎动不安、腹中冷痛以及吐血、衄血等病症。艾叶是温经、散寒止痛的要药之一，也是中医妇科常用药物之一。

艾叶首记载于梁·陶弘景《名医别录》中将其作用描述为“温经止血、散寒止痛”[1]。《中药学》将其归纳在止血剂这一章节，描述其性味为“性温，味辛、苦”。许多具有辛温性味的中药诸如生姜、干姜和辣椒等[2]可以活化热敏通道TRPV1，艾叶辛温之性也符合TRPV1激动剂的特征。现代中医临床多将艾叶用于妇科疾病的治疗，有较好的温经散寒、止痛作用。此外现代药理学研究证明，艾叶在抗炎、止痛方面发挥着显著作用[3]。但到目前为止，从分子层面研究艾叶温经散寒、止痛作用的分子机制还很少，推测艾叶发挥其温经散寒、止痛的功效可能是通过热敏通道TRPV1起作用的。为探讨生艾叶对TRPV1 的效应，本实验采用全细胞膜片钳技术测试生艾叶醇提物对细胞跨膜电流的影响。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器

1.1.1 药品 生艾叶于2016年3月份购自北京同仁堂(东四药店)。

1.1.2 试剂 TRPV1 plasmid(Origene，RC217653)，质粒GFP(北京爱思益普)、DMEM cell culture medium、Fetal Bovine Serum、penicillin/streptomycin(Gibco)、Lipofectamine2000(invitrogen)、Capsaicin、DMSO、Sodium chloride、Potassium chloride、Cesium chloride、EGTA、HEPES、Magnesium chloride hexahydrate、D-glucose、Calciumchloride(Sigma)。

1.1.3 仪器 SHZIII型循环水真空泵(上海亚荣)、数显恒温水浴锅HH-6(常州润华)、PatchMaster数据获取软件(Heka)、旋转蒸发器RE-52(上海虹昕)、P-97拉制仪器(Sutter Instruments)、IGOR-Pro分析软件(WaveMetrics Inc)、EPC-10 Quattro膜片钳放大器(Heka)、高速万能粉碎机BDW1-FW100(北京中西远大科技有限公司)等。

1.2 实验步骤

1.2.1 生艾叶75%乙醇提取物制备 称取生艾叶80 g，用粉碎机将其粉碎放入烧杯中，加入75%乙醇800 ml在室温下浸泡30 min；后将其放在调至95 ℃的恒温水浴锅上，用回流提取器提取2 h，在室温下将其冷却；用滤纸慢慢将液体过滤，剩余药渣再加500ml75%乙醇于回流提取器提取1 h，过滤后与上一次的滤液混合；2次得到的滤液放在旋转蒸发器上回收乙醇，所得的膏状物(不含乙醇)用蒸馏水调浓度至1 g/ml，-20 ℃冰箱分装保存备用。

1.2.2 细胞培养、转染和全细胞膜片钳实验 HEK293细胞用10%胎牛血清的培养基常规培养，置于37 ℃培养箱中培养，根据细胞生长情况进行换液和传代，等待细胞生长至融合度70%左右进行质粒转染实验。采用无双抗的完全培养基对转染上质粒的细胞进行培养，24～72 h内用于电生理实验。

1.2.3 全细胞膜片钳实验 电极内液包括HEPES 10 mmol /L，CsCl 140 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，MgCl22 mmol/L，ATP-Mg 1 mmol/L，CaCl25 mmol/L，用CsOH调pH 值7.2～7.3，自由Ca2+浓度维持在85 nmol/L，细胞外液为glucose 5 mmol/L，CaCl22 mmol/L，NaCl 140 mmol/L，KCl 5 mmol/L，HEPES 10 mmol /L，MgCl22 mmol/L，用 NaOH调至pH7.4。玻璃电极用拉制仪拉制而成并进行抛光，灌充电极内液放在电极夹持器上备用。在显微镜下选取细胞完整、横纹清晰的细胞用于实验，电极尖端接近细胞表面，接触到细胞表面时负压吸取形成高阻封接达到1 GΩ以上，封接完成后进行电极电容补偿，观察1～3 min形成全细胞记录模式[4]。膜片钳放大器放大并通过A/D、D/A界面控制刺激的发放和电压、电流信号的采集，并存储在计算机系统中。

1.3 统计学方法

2 结果与分析

2.1 生艾叶醇提物对转染TRPV1的HEK293细胞的影响

图1显示,TRPV1细胞外液将生艾叶醇提物稀释成3 mg(生药)/ml，观察其对表达TRPV1的HEK293细胞诱导跨膜电流。30 μmol/L辣椒素(capsaicin，Caps)产生的电流影响作为阳性对照，细胞外液对诱导产生的电流作为阴性对照。首先将细胞外液加入并观察电流的基线水平，待电流稳定后加入生艾叶醇提物观察电流变化，后用细胞外液进行洗脱，使电流恢复至基线状态，最后滴加30 μM辣椒素测试其对 HEK293细胞诱导产生的跨膜电流。实验结果显示，与细胞外液比较，生艾叶醇提物能够对转染TRPV1的HEK293细胞产生明显的跨膜电流(P<0.05)。

注： 左图：各测试组电流峰值对比统计图(+100 mV电压)。右图：跨膜电流时程图(+100 mV电压下)，用电压斜坡(voltage ramp)检测到I-V关系曲线，其中a、b、c分别代表细胞外液、生艾叶醇提物、辣椒素。*P<0.05，表示组间差异明显图1 转染TRPV1的HEK293细胞上生艾叶醇提物、辣椒素产生的电流效应

2.2 生艾叶醇提物对转染TRPV1的HEK293细胞的量效关系

图2显示，在对转染HEK293细胞的TRPV1跨膜电流影响的生艾叶醇提物量效关系研究中，将生艾叶醇提物与细胞外液稀释成3 mg/ml和10 mg/ml。结果显示，与正常细胞外液比较，生艾叶醇提物3 mg/ml、10 mg/ml这2个浓度均可以使细胞产生跨膜电流(P<0.01)，且10 mg/ml产生的跨膜电流大于3 mg/ml，甚至高于10 μmol/L辣椒素产生的跨膜电流。

注： 左图：各组与10 μM辣椒素活性百分比统计图(+100 mV电压)。右图：跨膜电流时程图(+100 mV电压)。** P<0.01图2 生艾叶醇提物对转染TRPV1的HEK293细胞产生的电流量效研究

3 讨论

本研究采用全细胞膜片钳技术旨在从细胞分子层面了解艾叶发挥散寒止痛可能作用的分子靶点，首次证明艾叶的醇提物能够激活热敏通道TRPV1产生跨膜电流，生艾叶中包含明确的活化TRPV1成分，这从细胞、分子层面对其发挥温经散寒、止痛功效作了相应的解释。

艾叶是温经止血药，用于少腹冷痛、经寒不调、宫冷不孕等。动物行为学实验显示，在原发性痛经小鼠模型中，艾叶有明显的止痛作用[1]。挥发油在镇痛作用方面功效显著，主要与降低血中前列腺素E2含量、调节体内超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、NO水平有关[2]。黄酮类成分现代研究则显示，在抗炎、镇痛方面也有一定的作用[3]，但这些作用的分子机制是未知的。

TRPV1是热敏通道家族的一员，它是热通道，能够被温度(≥43 ℃)、辣椒素和酸度[4]以及炎症因子所激活，介导着炎症、疼痛等病理过程[5]。一些芳香类中药活性成分是热敏通道激动剂，如辣椒素、生姜、大蒜、胡椒、花椒、樟脑、龙脑、薄荷醇、丁香酚等[5]。

既有的研究表明，艾叶所含主要TRPV1激动剂单独使用都不能取得比辣椒素更高的活化电流，但本实验在10 mg/ml的浓度下取得了比10Μm辣椒素更高的活化电流，该电流可能是一种叠加电流。既往研究推测一个方剂如川芎茶调散，多种中药包含不同的热敏通道激动剂，联合使用可以加强活化电流，从而增强疗效。本研究可能涉及另外一个机制就是1种中药含有多个热敏通道激动剂或抑制剂，干预1个或多个相关通道增强了疗效。如同艾叶这样的含有多个强热敏通道激动剂的中药是不多见的。因为中药使用艾叶入药非单一成分，因此研究粗提物的药理效应有重要意义。

艾叶的化学成分主要有挥发油，其次还有黄酮类、三萜类、桉叶烷类、鞣质类、多糖类及微量元素等，其中挥发油、黄酮类成分是艾叶的主要成分，亦是其有效成分[6]。艾叶挥发油一直被视为评价其药材质量的标准，随着现代化学分离技术的提高，艾叶挥发性成分已经由最初的十几种到现在检测出来的100多种,主要有1,8-桉叶素、龙脑、樟脑、丁香酚、薄荷醇、芳樟醇、α-蒎烯和β-蒎烯等[7-10]。在以单体进行的测试中发现，1,8-桉叶素可以活化热敏通道TRPV1、TRPA1和TRPM8[11]，樟脑[12]、丁香酚是TRPV1、TRPA1和TRPV3的激动剂，以及活化热敏通道TRPV3的如龙脑，活化热敏通道TRPM8的如薄荷醇和芳樟醇[13]。

热敏通道TRPV1、TRPA1负责伤害性感受刺激的传入，这些冲动由三叉神经节和背根神经节传至大脑，能够产生寒、热、痛等感觉[1]。许多辛味中药诸如辣椒、吴茱萸、干姜、生姜都对热敏通道TRPV1有激动效应，热敏通道的激动剂往往能使该通道致敏或脱敏，同时热敏通道之间还具有交叉脱敏特性。辛味中药TRPV1激动剂激活热通道，也能通过交叉脱敏寒通道TRPA1达到散寒目的。另一方面，热敏通道的功能障碍也能产生痛觉过敏，急性疼痛以TRPV1活化为主，慢性疼痛与TRPA1活化有关。这些热敏通道都不同程度地参与炎症性疼痛[14-15]。以宫寒为例，子宫上分布着大量的热敏通道[16]，妇科的慢性炎症可以活化TRPA1或TRPM8形成宫寒，而TRPV1的激动剂可以对抗这种作用[17]。

本实验的结果可以部分解释艾叶及其多样化的制剂发挥温经散寒、止痛作用的分子机制。在艾叶的复杂成分中,还有黄酮类成分含有芹菜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素等，以及三萜类和桉叶烷类成分，其药效可能还涉及其他机制。目前许多单体的测试工作尚未开展，今后有必要进行更深入的后续实验研究。